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松赤枯病是松树幼龄林上常见的病害,分布广,危害严重,自1974年开始发生危害,到1980年流行以来,已成为四川主要林木针叶病害,居林木病害首位。开展枯斑盘多毛孢菌生物学特性及致病毒素的研究对深入探索松赤枯病的发生发展规律、发病机理、防治方法有重要的理论和实践意义。本研究通过对马尾松赤枯病的生物学特性、毒素特性、致病机理及有毒活性成分的化学结构分析,首次得出如下结论: 1.碳、氮源筛选及生态因子研究表明,枯斑盘多毛孢菌(Pestalotia funera Desm.)适应性强,能在较大的pH范围内正常生长并产孢,其菌丝生长及产孢能力在相对较低的pH条件下有增强的趋势。在设定的碳、氮源条件下,得出其最佳营养生长培养基,即改良的察氏1号培养基(果糖30g KCl0.5g FeSO40.019 K2HPO41.0gMgSO4·7H2O 0.5g 蛋白胨3.0g),在该培养基上枯斑盘多毛孢菌营养生长最快(10.8mm/d),其最适生长温度为22℃~25℃,且在温度高于35℃时就停止生长;最佳产孢培养基即改良的察氏2号培养基(蔗糖30g KCl0.5g FeSO40.01g K2HPO41.0g MgSO4·7H2O 0.5g KNO32.0g),在该培养基上,枯斑盘多毛孢菌产孢能力最强且经过短期培养(接种后第8天)即可获得最大产孢量(7.47×10′个孢子/皿)。同时自然光和空气充足有利于枯斑盘多毛孢菌产孢。这些特性的阐明为进一步研究和利用枯斑盘多毛孢菌奠定了生物学基础。 2.枯斑盘多毛孢菌毒素粗提液的基本特性研究表明,毒素的产生与培养条件有关,马尾松赤枯病病菌在PD培养基中产毒最好,在这种培养基中加入松针浸出液对毒素的产生和活性没有促进作用。该菌产生的毒素是一类极性较大的非蛋白类物质,活性碳能对其进行吸附;该毒素能用甲醇将其从培养液中较好地提取出来。这些特性的揭示为深入研究毒素提供了可靠的生化依据。 3.不同的生测材料试验证实马尾松幼嫩的针叶对毒素的反应快而灵敏,且能产生典型的受害症状,是一种理想的生测材料。生测方法研究显示,与浸渍法、涂抹法相比较,针刺法不仅反应速度快,而且用量少,用针刺法处理待测针叶,由于粗提液多为植物材料所吸收,在生测过程中不易长出霉菌,使生测结果更为直观和准确。 4.毒素致病机理研究显示,马尾松针用毒素处理后可诱使寄主细胞膜脂发生过氧化反应,在处理后24小时即使MDA的含量变化达到最大(与对照相比高于对照48%人 最终造成对膜的伤害。处理后寄主组织的 PPO活性也较对照为高,说明毒索处理后寄主体内生理代谢发生了有害变化,组织的细胞膜在一定程度上受到了伤8。 5.分离纯化技术及毒素化学结构研究表明,通过对薄层层析展开剂及柱层析填料的筛选,得出正丁醇:甲醇:水u0:15:30)为最佳展开剂,硅胶 H 60型为最佳填料。以生测为导向,用硅胶 H60型柱反复柱层析,用正丁醇:甲醇:水历015:30)和不同浓度的甲醇水溶液为洗脱液,从松赤枯病菌的毒素中分离出 3种有致病活性的分子量较小的物质,通过质谱(MS*核磁共振谱卜 HNMR)和红外光谱口皿)等分析手段确定出所分离的活性组分为含氮植物多糖。活性组分1的化学 丫eNH。组成为 C。HllO。N(M=165),分于结构式为:\厂活性组分 2 的化学组成为 C10H19O10N(M—3!3),分子结构式为:丫\一O丫、口一NH。 \厂:活性组分 3的化学组成为q。H。。OgN(M == H >p-t y O*NHCHICIncffi325),分子结构式为:卜一寸yq