泊马度胺对多发性骨髓瘤MM1.S细胞未折叠蛋白反应及Cereblon影响的实验研究

来源 :甘肃中医药大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:zzdlily_4000
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目的:探讨第三代免疫调节剂泊马度胺对人多发性骨髓瘤细胞MM1.S的增殖、凋亡、周期、免疫调节剂结合蛋白CRBN及ERs相关分子mRNA及蛋白表达的影响,研究泊马度胺对MM1.S细胞CRBN蛋白及ERs相关分子的调控机制。方法:以多发性骨髓瘤MM1.S细胞为研究对象,复苏后得到半悬浮半贴壁细胞,观察细胞形态。取对数生长期细胞以手工细胞计数绘制细胞生长曲线,泊马度胺作用后CCK-8法检测细胞增殖情况,流式细胞术检测细胞凋亡及周期。后续实验分为2个部分:实验一(泊马度胺对CRBN mRNA及蛋白表达量的影响):根据泊马度胺浓度分为0umol/L,40umol/L及80umol/L 3个组别,分别应用RT-PCR及Western blot方法检测MM1.S细胞24h,48h及72h的CRBN表达量。实验二(泊马度胺对ERs相关分子(GRP78/BiP,XBP-1s及CHOP)mRNA及蛋白表达量的影响):根据40umol/L和/或80umol/L泊马度胺作用时间分为8个组(0h,4h,8h,12h,16h,24h,48h及72h),分别应用RT-PCR和Western blot方法检测ERs相关分子mRNA及蛋白表达量。结果:1.复苏及传代后的MM1.S细胞呈圆形,呈半悬浮半贴壁样生长;胞体直径约15-20μM,细胞核呈圆形,核染色质粗颗粒状排列,隐约可见2-4个核仁;胞浆量适中,为不透明的灰蓝色,呈泡沫状,可见伪足;对数生长期细胞成团,形似“葡萄串”,通过移液器易吹散为单个细胞悬浮状态。2.CCK8检测显示:与20umol/L组比较,24小时、48小时及72小时的细胞增殖抑制率均随POM浓度的增高而增加(P<0.05);与24小时比较,20umol/L组、40umol/L组及80umol/L组细胞抑制率均随POM时间作用的延长而增加(P<0.05)。3.流式细胞术检测凋亡:与对照组比较,24、48及72小时各组早期凋亡细胞比例随POM浓度的增高而增加(P<0.05);与24小时比较,早期凋亡细胞比例随POM作用时间的延长而增加(P<0.05)。4.流式细胞术检测周期:与对照组比较,24小时随POM浓度的增加各组G0/G1期的细胞比例增加,细胞增殖受抑(P<0.01);48小时随POM浓度的增加仅80umol/L组G0/G1期的细胞比例增加,细胞增殖受抑(P<0.01);72小时各期细胞比例无明显差异,细胞增殖未受明显影响(P>0.05)。5.RT-PCR检测CRBN mRNA的表达:与对照组比较,72小时CRBN mRNA相对表达量随POM浓度的增加逐渐减少,40umol/L及80umol/L组差异显著(P<0.05)。6.Western blot检测CRBN蛋白的表达:与对照组比较,72小时CRBN蛋白表达量随POM浓度的增加而减少,80umol/L组差异显著(P<0.05)。7.RT-PCR检测ERs相关分子mRNA的表达:(1)XBP-1 mRNA表达量:80umol/L的POM作用于MM1.S细胞,随时间延长,XBP-1mRNA表达量在0-12小时逐渐减少(P<0.05),16-24小时逐渐上升至最高(P<0.05),48-72小时下降(P<0.05)。(2)GRP78/BIP mRNA表达量:80umol/L的POM作用于MM1.S细胞,随时间延长,GRP78/BIP mRNA表达量在0-12小时逐渐减少(P<0.01),16-24小时逐渐上升至最高水平(P<0.01),48-72小时逐渐下降(P<0.01)。(3)CHOP mRNA表达量:80umol/L的POM作用MM1.S细胞,随时间延长,CHOP mRNA的表达量在0-16小时相对稳定,24小时后逐渐上升至72小时达最高水平(P<0.01)。8.Western blot检测ERs相关蛋白的表达:(1)XBP-1s蛋白的表达:以40umol/L POM作用于MM1.S细胞,随POM作用时间的增加,未剪接的XBP-1u和剪接的XBP-1s蛋白表达量均增加(P<0.01),2者均在24小时达最高水平,其中XBP-1u明显增加,24小时后XBP-1u、XBP-1s蛋白表达均减少,但仍高于0小时(P<0.05)。(2)GRP78/BIP蛋白的表达:以40umol/L POM作用于MM1.S细胞,随作用时间延长,GRP78/BIP蛋白表达量在0-24小时逐渐增加,且24小时达最高水平(P<0.01),在24小时后逐渐减少,但仍高于0小时组(P<0.05)。(3)CHOP蛋白的表达:以0umol/L、40umol/L及80umol/L POM作用于MM1.S细胞72小时,随POM浓度增加,CHOP蛋白表达量逐渐增加(P<0.05);以40umol/L POM作用于MM1.S细胞,随POM作用时间的延长CHOP蛋白表达量逐渐增加,至72小时达最高水平(P<0.01)。结论:1.泊马度胺呈浓度、时间依赖性抑制MM1.S细胞的增殖、诱导细胞凋亡、阻滞细胞周期在G0/G1期,并降低MM1.S细胞CRBN mRNA及蛋白的表达,因此泊马度胺发挥抗多发性骨髓瘤的活性与CRBN表达下调相关。2.泊马度胺引起MM1.S细胞内质网应激标志蛋白GRP78/BIP及内质网下游未折叠蛋白反应通路相关保护性蛋白XBP1 mRNA及蛋白表达量随时间先增后减;引起未折叠蛋白反应相关损伤性蛋白CHOP mRNA及蛋白表达量呈浓度、时间依赖性增加;因此,泊马度胺可以诱发MM1.S细胞内质网应激,并通过其下游未折叠蛋白反应参与细胞损伤的调节。
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