背景目前,肺癌已成为全球发生率、死亡率最高的癌种之一。其致病危险因素包括吸烟、环境因素、职业危害因素和遗传因素等。根据生物学特征、预后及治疗策略将肺癌分为非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)和小细胞肺癌(small cell lung cancer,SCLC)两大类,其中非小细胞肺癌约占80%～85%,小细胞肺癌占10%～15%。近年来,随着肺癌分子靶向治疗的迅速发展,表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor,EGFR)酪氨酸激酶抑制剂(tyrosine kinase inhibitors,TKIs)已成为EGFR基因敏感突变阳性晚期NSCLC患者的标准一线治疗方案,其肿瘤缓解率、无进展生存和生活质量均比传统的含铂双药化疗显著提高。随着“精准医学”时代的到来,监测EGFR-TKI的疗效、患者基因谱的动态变化显得异常重要。目前,以组织和细胞学标本进行EGFR基因突变检测用于指导NSCLC患者的EGFR-TKI治疗成为标准临床实践。但在临床实践中,有创的活检方式往往难以重复实施,所获得的组织标本也往往有限,而且单次的小标本组织活检无法避免肿瘤时间和空间异质性。基于组织活检的种种局限性,而血浆中存在一定量的循环肿瘤DNA(circulating tumor DNA,ctDNA),其遗传学特征与肿瘤细胞相同,固然是肿瘤组织理想的补充标本。多项研究证实,血液ctDNA中EGFR突变阳性患者的EGFR-TKI疗效均优于标准双药化疗。2014年9月,欧洲药品管理局批准了当难以获取肿瘤组织标本时,可采用外周血ctDNA作为补充标本评估EGFR基因突变状态。随后在2015年2月,CFDA也已批准吉非替尼说明书进行更新,在推荐所有NSCLC患者的肿瘤组织都应进行EGFR基因突变检测基础上,补充了如果肿瘤标本不可评估,则可使用从血液(血浆)标本中获得的ctDNA进行评估。2015年12月,中国发布了《非小细胞肺癌血液EGFR基因突变检测中国专家共识》,进一步奠定了血检在临床实践中的重要地位。多项meta分析显示,外周血EGFR突变检测敏感性约65%,特异性可达90%以上,并具高的临床疗效预测准确性。本研究的第一部分选取本中心部分晚期NSCLC患者,用了两种方法——高灵敏度的微滴式数字PCR(droplet digital PCR,ddPCR)和cobas方法对其血浆ctDNA进行EGFR敏感突变及T790M耐药突变的检测,与肿瘤组织ARMS法的EGFR检测进行比较,更全面地观察EGFR血检的有效性及其与疗效的关系。即便EGFR-TKIs在伴EGFR敏感突变的NSCLC患者中取得很好疗效,但几乎所有患者最终将出现耐药而发生疾病进展,其中EGFR基因第20号外显子的T790M点突变约占了全部TKI继发耐药机制的60%。既往研究发现,在首次服用TKI患者中,治疗前伴T790M突变患者的无进展生存差于不伴T790M突变患者,而TKI耐药后伴T790M突变患者的预后较好,可见T790M有很重要的预测作用。虽然临床研究已证实三代TKI能在T790M突变阳性患者中取得惊人的疗效,其代表药物AZD9291也已经在美国、欧盟获批上市,但在中国大陆以及世界上众多国家地区,三代TKI短期内无法获批。因此,一代TKI耐药后的治疗策略非常有限,仍有许多患者在整个抗肿瘤治疗过程中会再次服用一代TKI,而在此类患者中,T790M所扮演的角色是否相似呢?临床上能否根据T790M的突变状态来筛选适合再挑战TKI的人群呢?关于这个问题,目前尚未见学者报导。因此,本课题的第二部分总结了本中心近10年来所有再挑战一代TKI的晚期仅EGFR基因突变阳性的NSCLC临床资料,旨在探讨T790M突变在二次服用TKI的晚期NSCLC患者中的预测作用。第一部分 晚期非小细胞肺癌患者血浆EGFR突变检测目的探讨cobas及微滴式数字PCR血检对晚期非小细胞肺癌患者的临床实用价值。方法1.cobas 血检共收集了118例我院首诊局部晚期/晚期NSCLC患者的血浆标本,这些患者均在确诊时进行了 ARMS法的组织EGFR基因突变检测,我们对同期配对的血浆标本进行了 cobas血检,并对其中11例肿瘤组织L858R突变阳性的患者进行了血浆动态的EGFR检测。这118例中,50例患者组织EGFR为野生型,68例患者为EGFR敏感突变型,这68例患者的血浆采集时机均未经EGFR-TKI治疗。所有患者的基因检测、标本采集均取得患者的知情同意。用IBM SPSS 22.0(美国,纽约)软件进行统计学分析,组间比较用Log-rank分析,所有P值用双侧检验,以α=0.05为检验水准,P<0.05则认为有统计学意义。2.ddPCR 血检选取了 79例我院确诊的局部晚期/晚期NSCLC并伴有EGFR敏感突变阳性的患者(其中56例是与上述cobas重复的患者),这些患者均在确诊时进行了ARMS法的组织EGFR基因突变检测,我们用高灵敏度的微滴式数字PCR方法对同期的血浆标本进行检测,共检测了三种突变类型:19号外显子缺失突变、21号外显子L858R突变以及20号外显子的T790M突变(仅对有足够标本的63例患者进行了 T790M检测)。这79例中包括68例未经EGFR-TKI治疗的血浆标本和11例经TKI治疗后出现RECIST疾病进展的血浆标本。所有患者的基因检测、标本采集均取得患者的知情同意。用IBMSPSS22.0(美国,纽约)软件进行统计学分析,组间PFS比较用Log-rank分析,组间cfDNA比较用两独立样本的t检验,两种检测方法的吻合度分析、相关性分析分别用卡方检验和曲线拟合,所有P值用双侧检验,以α=0.05为检验水准,P<0.05则认为有统计学意义。结果1.cobas 血检1.1敏感性、特异性和一致率以肿瘤组织ARMS法检测为金标准,cobas血检的敏感性、特异性和一致性分别为71.0%、93.2%和79.6%。阳性预测值为94.2%,阴性预测值为67.2%。对于EGFR突变阳性患者,得到的SQI值可以间接反映其突变丰度。1.2血浆EGFR动态变化类型在11例L858R突变的血浆动态检测中,我们发现有3种主要动态变化类型:SQI值由服药基线迅速下降,随着疾病进展逐渐上升(n=5);SQI值由服药基线迅速下降,但在疾病进展时无上升(n=2);SQI值在服药期间无明显变化,但疾病进展时升高(n=2),余2例为血浆EGFR持续野生型。此外,一共3例患者在临床疾病进展前检测出血浆T790M突变,最早者能提前一个月出现。1.3血浆EGFR突变状态与TK1疗效在66例组织EGFR敏感突变阳性并且服用了 EGFR-TKIs的患者中,EGFR血检阳性组(n=46)与血检阴性组(n=20)的无进展生存未见统计学差异(12.2m vs.14.7m,P=0.324)。2.ddPCR 血检2.1敏感性在这79例经ddPCR检测的样本中,3例质控不合格予以剔除。以肿瘤组织ARMS法检测为金标准,数字PCR的敏感性为65.8%,其中E19-Del和L858R的敏感性分别为65.9%、65.6%。在52例未经TKI治疗的患者中,血浆T790M检出率为0.04%(2/52),而在11例TKI进展后的患者中,血浆T790M检出率为27.3%(3/11)。2.2血浆EGFR突变状态与TKI疗效在63例组织EGFR突变阳性并且服用了 EGFR-TKIs的患者中,EGFR血检阳性组(n=42)与血检阴性组(n=21)的无进展生存未见统计学差异(16.0mvs.13.3m,P=0.764)。2.3肿瘤负荷与血浆EGFR敏感突变血浆EGFR敏感突变阳性组(n=50)与阴性组(n=26)的中位cfDNA拷贝数分别为5934copies/ml和2884copies/ml,阳性组明显高于阴性组,两组差异有统计学意义,P=0.017。3.ddPCR 与 cobas 血检我们对56例患者同时用了 cobas和ddPCR做了血浆EGFR基因突变检测,两种方法的吻合度一般(Kappa=0.397,P=0.003)。在双阳性患者中,曲线拟合得出SQI值与ddPCR的突变百分比值存在较强的相关性,E19-Del的R2=0.663,P<0.001,L858R 的 R2=0.832,P<0.001。结论1.用微滴式数字PCR和cobas检测EGFR突变阳性的晚期非小细胞肺癌患者血浆ctDNA的EGFR基因突变具临床实用价值,可以作为肿瘤组织的补充手段;2.两种方法检测EGFR敏感突变的效能相似,cobasSQI与ddPCR的突变丰度有较强的相关性;3.血浆EGFR的连续监测可帮助预测TKI疗效及耐药;4.血浆T790M可比临床疾病进展提前出现;5.高肿瘤负荷患者可能是血浆因GFR检测的理想人群。第二部分T790M突变对再挑战EGFR-TKIs的预涵作用目的1.探讨T790M突变对EGFR突变阳性晚期非小细胞肺癌一代EGFR-TKIs耐药后,再次挑战EGFR-TKIs的疗效预测作用。2.分析本中心再挑战EGFR-TKI非小细胞肺癌患者的疗效和预后。方法筛选出2004年12月至2014年12月间,在本中心服用两次或以上的吉非替尼或厄洛替尼的EGFR突变阳性晚期NSCLC患者。入选标准:(1)组织学或细胞学诊断为非小细胞肺癌;(2)经直接测序法或蝎形探针扩增阻滞突变系统(scorpions amplification refractory mutation system,Scorpions ARMS)确定为EGFR敏感突变阳性的肺癌患者;(3)服药基线的TNM分期为IIIB期或IV期;(4)在首次EGFR-TKI进展后的任意时刻再次服用了吉非替尼或厄洛替尼药物。对于首次TKI进展后行了二次活检并进行了 T790M检测的患者,我们对其进行组间疗效和生存的比较。组间的生存期比较用Log-rank法,组间临床特征、反应率比较用卡方检验,若理论频数小于5则用Fisher确切概率法。用IBM SPSS 22.0(美国,纽约)软件进行统计学分析,无进展生存期(Progression-free survival,PFS)和总生存期(Overall survival,OS)均从第二次服用吉非替尼/厄洛替尼开始计算,所有P值用双侧检验,以α=0.05为检验水准,P<0.05则认为有统计学意义。结果1.所有再挑战患者的疗效、预后总共筛选了 922例患者,仅66例肺腺癌患者符合入选条件,这些患者均不伴原发T790M突变。66例患者的中位无进展生存期、中位总生存期分别为2m和6.8m,疾病控制率和客观缓解率分别为6.1%和39.4%。Cox多因素回归分析显示,ECOG performance status(PS)评分好的患者比PS评分差患者能获得更长的总生存期(hazard ratio[HR]0.32,95%Cl,Confidence Interval,0.18-0.57,P<0.001),TKI间歇期≥3m可能是独立的良好预测因子(HR 0.56,95%CI 0.31-1.00,P=0.051),而其他因素如EGFR突变类型(E19-Delvs.E21-L858R)、首次无进展生存(<6mvs.>6m)、间歇化疗(有vs.无)、TKI间歇期(<3mvs.>3m)则不是无进展生存期、总生存期的独立影响因素。2.T790M突变的预测作用在51例首次TKI疾病进展后进行了二次活检的患者中,T790M+(n=18)和T790M-(n=33)组的中位无进展生存期分别为1.8m和2.0m,中位总生存期分别为7.7m和6.8m,两组均无统计学差异(P=0.261;P=0.814)。同样,两组的疾病控制率和客观缓解率也未见显著统计学差异(P = 0.829;P = 0.284)。两组的临床特征如性别、年龄、吸烟史、PS评分、EGFR类型、TKI间歇期、首次TKI的无进展生存、间歇化疗情况、TKI种类、再挑战时机、检测方法以及进展类型均无显著统计学差异。结论1.T790M突变与EGFR突变阳性晚期肺腺癌患者首次一代EGFR-TKI耐药后,再挑战一代TKI的疗效、预后可能无关;2.对于首次一代EGFR-TKI进展后的EGFR突变阳性肺腺癌患者,不推荐常规再挑战TKI策略,但对于TKI间歇期长以及PS评分好的人群,可作为选择之一。