维生素K环氧化物还原酶(VKOR)，是一种广泛存在于动物、植物及微生物中的膜蛋白。植物VKOR的最新研究表明，此蛋白定位于叶绿体并具有氧化还原酶功能。Annexins是一类在植物逆境胁迫过程中起到重要作用的依赖于Ca2+与生物膜结合的膜联蛋白多基因家族，Annexin1有过氧化酶活性并与植物对逆境胁迫的应答有关。　　 本文利用野生型、VKOR缺失突变体及突变体补偿型拟南芥，研究了逆境条件下VKOR基因对Annexin1在转录水平、翻译水平的影响，这有助于阐明植物抗逆应答机制并对提高作物抵抗逆境能力提供了理论依据。主要研究结果如下:　　 (1) AnnAT1基因的克隆、表达和抗体制备。查询NCBI网站基因库，设计引物扩增Annexin1蛋白的基因AnnAT1，构建原核表达重组质粒pET-AnnAT1，转化大肠杆菌BL21;将重组质粒菌株进行IPTG诱导蛋白表达，利用亲和层析将重组蛋白纯化后注射小鼠，制备得到高效价Annexin1抗体，为以后Annexin1蛋白检测做准备。　　 (2) AnnAT1的表达提高了原核细胞抵抗逆境胁迫的能力。在LB固体培养基中加入甘露醇、氯化钠和氯化钾进行胁迫处理，将菌株接种到不同培养基中，观察在含有重组质粒与空质粒菌落生长的差别，结果表明，非胁迫处理下，AnnAT1的表达并不影响大肠杆菌的繁殖速度，而胁迫条件下，包含AnnAT1重组质粒的菌落数明显高于包含空质粒的菌株。以甘露醇、氯化钠、氯化钾和PEG胁迫处理，LB液体培养结果表明，在有渗透调节剂(甘露醇或PEG)或盐（氯化钠和氯化钾）存在下，Annexin的表达使菌株的生长速度高于空质粒菌株对照。这说明，AnnAT1表达明显增强了原核细胞的抵抗逆境胁迫的能力。　　 (3)拟南芥VKOR影响逆境胁迫下AnnAT1转录水平的表达。我们以拟南芥野生型WT、VKOR缺失突变体lto1-2和VKOR缺失后补偿型lto1-2C为材料，分别进行了盐胁迫(150mM NaCl)和干旱胁迫（离体叶片失水）两种处理，提取不同处理时间下的样品RNA，以Tublin基因为内参，qRT-PCR方法测定不同样品Annexin1的mRNA水平表达变化，结果显示，盐胁迫24h和干旱胁迫3h时，叶片内AnnAT1的mRNA水平都达到最高峰;两种逆境过程中，lto1-2的Annexin1的RNA水平表达都显著低于WT和lto1-2C，而WT和lto1-2C的表达基本一致。这说明VKOR的缺失影响了Annexin1的转录水平的表达。　　 (4)拟南芥VKOR影响了逆境胁迫下AnnAT1的翻译水平的表达。对不同材料的叶片进行盐胁迫和干旱胁迫处理，提取叶绿体类囊体，利用之前制备的Annexin1的抗体进行Western Blot检测，结果显示，盐胁迫24h和干旱胁迫3h时，AnnAT1的蛋白表达量都达到最高值;lto1-2的翻译水平的表达明显低于WT和lto1-2C，后两者的表达基本一致。这说明VKOR的缺失影响了AnnAT1的翻译水平的表达。　　 (5)逆境下VKOR的缺失导致拟南芥活性氧积累量升高。根据前面的实验结果，选取野生型和突变体mRNA和蛋白水平表达差异最大的时间段，检测叶片活性氧情况，结果表明，突变体lto1-2的负氧离子和过氧化氢积累量显著高于WT和lto1-2C，而后两者的积累量基本一致。这说明，在逆境胁迫下，拟南芥VKOR的缺失导致体内负氧离子和过氧化氢大量积累，可能与Annexin1表达量下降有关。