背景不孕不育是世界性难题,是现代社会影响人类生活和健康的三大主要疾病之一。随着社会的发展与环境污染的加重,不孕不育的形势将变得更加严峻。而精索静脉曲张(Varicocele,VC)作为男性不育的重要原因,越来越受到人们的关注。VC在所有男性不育病因中占19-41%,也是通过治疗可以纠正的最多的病因。VC对不同的病人的影响表现出较大的异质性,VC对精液的影响变化极大,可以表现为无精症,也可以表现为少精、弱精或畸形精子症,还有报告VC患者可以正常生育。因此探讨VC导致不育的机制具有特殊重要的意义。关于精索静脉曲张所致男性不育的确切机制至今尚未阐明,但相关研究主要集中在以下方面：1.缺氧；2.氧化应激；3.睾丸微循环障碍;4.血管活性物质的毒性作用；5.一氧化氮(NO)机制；6.免疫因素；7.生精细胞凋亡；8.分子遗传学改变(如Y染色体微缺失和谷胱甘肽转移酶M1基因多样性)；9.激素分泌紊乱等。其中,缺氧在VC所致男性不育中的作用越来越引起人们的重视,缺氧等相关因素的影响已逐渐成为学者对精索静脉曲张引起不育机制的研究热点。缺氧诱导因子(HIF)是组织缺氧时所产生的特异性因子,其含量与缺氧程度成正比。HIF-1α是HIF的功能性亚基,其研究最为广泛与深入。HIF-1α在缺氧条件下能够进入细胞核,与HIF-1β结合形成HIF-1,启动靶基因的转录,如：促红细胞生成素(EPO)、血管内皮生长因子(VEGF)等,从而使组织细胞适应低氧环境。相关研究已证明,左侧精索静脉曲张的大鼠左右两侧睾丸HIF-1α均为过表达,双侧睾丸组织均存在缺氧。缺氧时,生精细胞DNA受到损害,畸形精子生成增加,而发生DNA损害的生精细胞会因为细胞凋亡而发生细胞死亡,进而被清除,这与我们在临床上所见的精索静脉曲张不育患者精液中畸形精子增多的现象不符合。因此,我们有必要对这一机制进行深入的研究。动物模型在我们的研究中有着不可替代的作用,它是我们研究的基础与前提。良好的模型复制方法能够提高复制成功率,为我们的实验提供保障。精索静脉曲张大鼠模型可复制性强,建模方法相对较为成熟,是我们进行研究的首选,在既往的相关研究中运用也最为普遍。但大鼠体积小,血管细,组织结构比邻相对近,睾丸静脉回流解剖特点与人有差异,增加了我们建模的难度,建模时易出现大血管损伤、误扎输尿管等并发症。为减少并发症、提高建模成功率,精索静脉曲张动物模型的建立方法及方式需要我们进一步探索与改进。研究目的一、通过将显微镜应用于精索静脉曲张大鼠模型的建立,探索建立精索静脉曲张大鼠动物模型新的方法与方式,初步探讨显微镜在建模手术中的优势；二、通过对精索静脉曲张大鼠睾丸组织中与缺氧相关蛋白的检测,探讨精索静脉曲张导致不育的缺氧机制,研究缺氧在精索静脉曲张导致不育机制中的作用。研究方法一、建模1.麻醉以戊巴比妥钠按50mg/kg剂量行大鼠腹腔内注射进行麻醉。2.普通手术建模将麻醉后的大鼠仰卧位固定,取长约5cm的下腹正中切口进入腹腔,找到左肾静脉,用4-0丝线将左肾静脉连同一直径0.7mm金属探杆一同结扎,抽出探杆,使左肾静脉部分缩窄,造成静脉内高压。再将左侧精索静脉的分支予以结扎,保证精索静脉内的压力,使精索静脉曲张。3.显微镜手术建模麻醉、体位及手术原理同普通手术建模。开腹后使用手术显微镜,在其视野下部分结扎左肾静脉并结扎左侧精索静脉的分支。4.建模成功的标准4周后剖腹探查,观察大鼠左侧精索静脉有无曲张,以及左肾有无损害。以左侧精索静脉直径≥0.5mm且左肾体积与颜色无明显变化者为建模成功。5.数据比较及统计学分析比较普通手术组与显微镜手术组的手术并发症发生率,如肾静脉损伤、下腔静脉损伤等,以及通过术后的剖腹探查,来比较两组的建模成功率、死亡率等指标有无差异。二、免疫组化取出成功建成左侧精索静脉曲张模型的30只大鼠的双侧睾丸(实验组),以及30只未予处理的大鼠的左侧睾丸(对照组),沿其长径切开,分别置于4%多聚甲醛中进行固定,送至我长海医院病理科予石蜡包埋,切片后进行免疫组化实验,检测组织中HIF-1α、EPO、EPOR的表达情况,通过半定量分析法对各因子的表达进行评分。对评分进行统计学分析,比较实验组与对照组表达的差异,及各因子间的相关性。三、统计分析两样本率的比较使用χ2(Chi-square test)检验或使用四个表资料的Fisher确切概率法检验；随机设计多个样本的比较使用Kruskal-Wallis H检验,多个样本两两比较使用Nemenyi法检验,配对样本的比较采用Wilcoxon符号秩检验,两样本的相关性检验使用Spearman秩相关。P<0.05有统计学意义。结果一、普通手术建模组共60只大鼠,其中术中因下腔静脉损伤至大出血死亡1只,分离左肾静脉时造成肾静脉破裂出血至死亡4只,术后死亡7只,其中因发生肠梗阻死亡3只,意外死亡2只,不明原因死亡2只。术后4周剖腹探查,出现左肾积水4只,左肾坏死1只,左侧精索静脉曲张不明显6只,发现左侧精索静脉直径扩张≥0.5mm37只。去除意外死亡2只后,建模成功率63.79%,死亡率17.24%,并发症发生率25.86%。显微镜手术建模组共30只大鼠,术中未出现下腔静脉或肾静脉等大血管破裂而造成动物死亡。术后4周剖腹探查,左肾积水或坏死等损害未见发生,左侧精索静脉曲张不明显2只,左侧精索静脉直径扩张≥0.5mm28只。建模成功率93.33%,死亡率0,并发症发生率0。显微镜手术组建模成功率高于普通手术组,差异具有统计学意义(P<0.05),动物死亡率以及术中、术后并发症发生率低于普通手术组,差异具有统计学意义(P<0.05)。二、免疫组化结果HIF-1α在实验组大鼠左侧睾丸、右侧睾丸过表达,在对照组大鼠左侧睾丸内阴性表达,表达差异有统计学意义(P<0.05),三组间两两进行比较,其表达强度实验组左侧睾丸>实验组右侧睾丸>对照组左侧睾丸,差异均有统计学意义(P值均<0.05)；EPO在实验组大鼠左侧睾丸、右侧睾丸过表达,在对照组大鼠左侧睾丸内阴性表达,表达差异有统计学意义(P<0.05),三组间两两进行比较,其表达强度实验组左侧睾丸>实验组右侧睾丸>对照组左侧睾丸,差异均有统计学意义(P值均<0.05)；EPOR在实验组大鼠左侧睾丸、右侧睾丸过表达,在对照组大鼠左侧睾丸内阴性表达,表达差异有统计学意义(P<0.05),三组间两两进行比较,其表达强度实验组左侧睾丸>实验组右侧睾丸>对照组左侧睾丸,差异均有统计学意义(P值均<0.05);在各实验组中HIF-1α、EPO与EPOR的表达两两之间具有正相关性(P<0.05)。结论一、显微镜下手术建立精索静脉曲张大鼠模型同普通手术相比具有明显优势,建模成功率高,死亡率及并发症发生率低;二、缺氧通过HIF-1α调节EPO、EPOR的表达,抑制了畸形精子的凋亡,造成异常精子数目的增加,影响精子质量;三、左侧精索静脉曲张可导致双侧睾丸缺氧,影响精子发生,因此仅一侧精索静脉曲张即可引起不育。