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虫草素(Cordycepin,简称CCS)又名3’-脱氧腺苷,是从人工蛹虫草子实体中分离出的一种小分子核苷类物质,为我国传统中药材冬虫夏草的有效活性成分。虫草素具有多种药理作用活性,如抗病毒、抗肿瘤、抗真菌等。前期经高脂饲料喂养的金黄地鼠动物模型观察发现,虫草素具有良好的降血脂作用,尤其对甘油三酯的代谢调节最为显著。采用蛋白免疫印迹法和荧光素酶报告基因检测法在细胞水平初步证实,虫草素降低甘油三酯的作用与激动PPAR-γ方式相关性较差,提示虫草素降血脂作用可能存在着与传统降血脂药物不同的分子机制。本课题组在近期的体内外实验研究中发现,虫草素可明显上调腺苷酸活化蛋白激酶(AMP-activated protein kinase, AMPK)磷酸化表达。计算机模拟分子对接发现虫草素与AMPK具有较好的静电作用、疏水作用和氢键相互作用。据此推测,虫草素的降血脂作用与激活调节机体细胞能量状态的中心传感器——AMPK有重要关系。本文以虫草素在模拟人类脂质代谢异常的细胞模型中的作用,通过细胞分子生物学、蛋白组学、RNA干扰等技术手段探索其作用靶标,以确证AMPK为虫草素降血脂作用的主要作用靶点,并进一步揭示了虫草素激活AMPK的主要作用机制。采用MTT法测定虫草素对HepG2细胞的细胞毒性；使用油酸刺激细胞,建立HepG2细胞脂质堆积模型,Western blot观察虫草素对脂代谢异常细胞内AMPK和ACC磷酸化蛋白表达的影响；油红O(Oil Red o)染色和试剂盒检测法,观察虫草素对脂质代谢异常的细胞内脂质调节作用：采用UPLC、Western blot、RNA干扰手段,考察虫草素对AMPK信号传导通路的影响；通过慢病毒感染沉默HepG2细胞AMPKγ1基因表达,观察AMPKγ1基因对虫草素上调AMPK磷酸化蛋白表达及脂质调节作用的影响。结果显示,虫草素0.01～10μmol·L-1与HepG2细胞分别作用24、48、72h后,细胞存活率并未受到明显抑制；Western blot结果表明,虫草素1Oμmol·L-1可显著上调脂代谢异常细胞内AMPK和ACC磷酸化蛋白表达；油红O染色和试剂盒测定结果表明,虫草素能够显著改善脂代谢异常细胞模型中的脂质堆积,下调脂总胆固醇(TC)和甘油三酯(TG)水平；采用HPLC、Western blot及RNA干扰技术观察虫草素对AMPK信号传导系统影响发现,虫草素激活AMPK并不受细胞内AMP/ATP水平及AMPK上游激酶LKB1、CaMKK活性的影响：采用慢病毒干扰手段沉默HepG2细胞AMPKγ1基因表达后,虫草素激活AMPK及调节脂质代谢作用被明显抑制。综上所述,虫草素激活AMPK主要是通过直接作用于AMPKγ1这一靶点实现的,AMPK为虫草素调节脂质代谢的主要作用靶点。