血管紧张素II(AngII)是重要的致心肌肥厚因子,它可以引起心脏的变时、变力效应及引起细胞增殖等[1],这些作用大部分都是由AngII受体1型(AT1)来介导完成的。　　 钙/钙调蛋白依赖性激酶(CaMK)是细胞内重要的钙调节蛋白,心脏中主要表达的异构体为CaMKII。有研究发现在肥大心肌和衰竭心脏中,CaMKII的表达也是升高的[2]。那么,CaMKII是否存在于AngII-AT1信号通路上?　　 我们通过一系列的实验证实,在经转染质粒表达AT1和CaMKII的COS7细胞中,AngII可以引起p-ERK活性增高,且p-ERK活性增高程度较单转染AT1质粒的细胞为高;CaMKII与AT1可发生结合,但AngII、AT1受体拮抗剂(ARB)对此种结合无明显影响。而CaMKII的无功能突变体DN不能传递AngII信号。提示CaMKII引起心肌肥大的作用与AngII经AT1传递的信号通路只是部分相关,而主要是通过其他未知的信号通路。　　 总实验分为四个部分:　　 第一部分建立表达AT1和CaMKII/DN的转染COS7细胞　　 AT1、CaMKII/DN表达质粒由本实验室构建。通过大肠杆菌JM109扩增、AMP筛选及试剂盒抽提得到相关质粒,经EcoRI+NotI内切酶双消化鉴定AT1,得到目的AT1片段约为1.1kb左右长度;EcoRI+BamHI内切酶双消化鉴定CaMKII/DN,得到1.8kb左右长度目的CaMKII/DN质粒片段,表明扩增成功。通过磷酸盐钙沉淀法将不同质粒组合转入COS7细胞内。分别提取转染细胞中的胞膜蛋白及胞浆蛋白,免疫印迹法(WB)可测得AT1及其所带的HA-tag、CaMKII及其所带的Vs-tag;免疫荧光法(IF)可测得细胞表达AT1/HA、CaMKII/DN/V5,而未转染细胞中未能测得相应蛋白,表明质粒成功转入COS7细胞内。结论:转染细胞模型成功建立。　　 第二部分测定双转染后表达的AT1+CaMKII/DN对AngII的p-ERK反应性分别给予转染AT1+CaMKII/DN的细胞以AngII刺激,WB测定随时间变化胞内p-ERK的改变。另给予单转染AT1、CaMKII、DN的细胞以AngII刺激或ARB预处理后再AngII刺激,WB测定胞内p-ERK的改变。结果:经AngII刺激,转染AT1+CaMKII组于7min左右p-ERK活性达到最高峰,AT1+DN组在7min作用出现一个明显的p-ERK活性抑制峰,经给予ARB预处理后这种作用消失;单转染细胞中,转染AT1组出现p-ERK活性升高并可被ARB消除的现象,阴性对照组、转染CaMKII组和转染DN组则无此现象。结论:AT1和AT1/CaMKII均可传递AngII的肥厚信号,DN及单纯CaMKII不能传递AngII的肥厚信号。　　 第三部分测定双转后表达的AT1和CaMKII/DN在AngII、ARB等处理下的结合情况　　 给予转染AT1+CaMKII/DN的细胞不同时间的AngII刺激,处理后提取膜蛋白,标化浓度后行免疫共沉淀(co-IP)测定AT1上结合的CaMKII/DN情况随时间变化情况。然后进行分组实验:不处理组(一)、单予AngII刺激组(II)、单予ARB组(R)、先ARB预处理后再给予AngII组(RII)。Co-IP+WB检测AT1上结合的CaMKII量。统计分析最终WB条带灰度值。结果:时间曲线显示从0、1、3、5、7到10min时AT1上均有CaMKII结合,5-7min结合量最高;DN亦可结合AT1,但未发现结合量有随时间的渐进性变化。分组实验中II、R及RII组较(一)组均无明显差异。结论:AT1可与CaMKII/DN结合;AngII及ARB对AT1上结合的CaMKII量均不存在影响。　　 第四部分测定双转后AT1和CaMKII/DN经AngII、ARB等处理后在细胞内的相对分布情况　　 分别给予转染AT1+CaMKII/DN的细胞以单纯AngII、ARB预处理后AngII刺激等不同干预,按IF方法进行目的蛋白标记,激光共聚焦显微镜下观察AT1和CaMKII/DN的胞内相对分布情况。结果:与阴性对照组比较,AngII刺激达7min左右CaMKII出现于细胞核内,ARB预处理后消失;DN的核内分布及胞内分布与AngII、ARB基本无关;AT1和CaMKII/DN相对分布变化不明显。结论:AngII及ARB对AT1与CaMKII/DN的细胞内分布均不存在影响,但可影响CaMKII的核内分布。