论文部分内容阅读
前言 细胞周期调控及其与癌变的关系是当前细胞生物学研究的热点。其中细胞周期素依赖性激酶（cyclin-dependent kinase，CDK）与细胞周期素（cyclin）复合物的形成、激活与失活是细胞周期调控的主要分子基础。CDK2是CDK家族中的重要成员，它直接参与细胞周期G1／S限制点、S期DNA复制和中心体复制的调节，它的活性和功能调节是细胞周期运转的的关键环节之一，与细胞癌变有着十分密切的关系。DOC-1R（Deleted in.oral cancer-1related）基因是张学教授等发现的一个候选抑癌基因，体外实验证明DOC-1R蛋白能够与CDK2蛋白结合，其在细胞内可能具有抑制CDK2蛋白入核转运而活化的生理功能，因此DOC-1R可能为CDK2专一性抑制因子（CDKinhibitor，CDI）。我们结合转染技术及间接免疫荧光技术，观察细胞内DOC-1R转染基因表达对于DNA复制以及中心体复制的影响。另外，我们对CDK2蛋白质序列与其入核转运过程关系进行了初步分析，并构建了原位示踪外源目的基因表达的工具性载体pZX，转染细胞后该载体具有使目的蛋白与细胞膜标志蛋白同时独立表达的优势，并能够与流式细胞仪、间接免疫荧光技术相结合，为进一步研究DOC-1R蛋白的表达对于CDK2细胞内定位的影响及其在细胞周期调控中的作用提供实验基础。 实验方法 1．pEGFP-CDK2、pEGFP-CDK2N和pEGFP-CDK2C重组载体的构建以pCMV-CDK2载体DNA为模板，分别通过不同的引物经PCR扩增野生型及两种缺失型CDK2基因，在其5’和3’分别含有HindⅢ和BamH Ⅰ的酶切位点。以限制性内切酶HindⅢ和BamH Ⅰ分别消化pEGFP-C3载体和经酚／氯仿抽提的PCR产物，将片段回收后经T4 DNA连接酶连接形成重组载体。转化后经菌落PCR筛选阳性菌落。扩增阳性菌落、提取质粒，以限制性内切酶HindⅢ和BamH Ⅰ进行酶切鉴定，并采用Sanger双脱氧末端终止法进一步进行序列测定分析，检测野生型及两种缺失型CDK2基因插人片段的序列及开放阅读框架的正确性。 2.CDKZ蛋白质序列与其人核转运过程关系的初步分析 将pEeFP一en粗、pEe即一eDKZN和pEGFp一CDKZC重组载体分别转染人类宫颈癌细胞系HeU和中华仓鼠卵巢细胞系CHO，采取血清饥饿及添加核昔酸还原酶抑制剂的方法进行细胞周期同步化后，以转染pEGFP-CDKZ的细胞为对照组、转染pEGFP一CDKZN和pEGFP一CDKZC的细胞为实验组，分别对其荧光定位进行观察、照相及分析。 3.原位示踪外源目的基因表达的工具性载体PzX的构建和改建 应用重组DNA技术，以Srnal和BamHI消化pIRESne。载体得到IRES片段，连接到peDNA3的EcoR WBamHI酶切位点，形成重组载体peD-NA3一I甩s。合成HRAsc20A和HRAsc20B寡核酸片段，杂交后连接到pEGFP一C3载体的Hindlll和BamHI酶切位点，形成重组载体pEGFprascZo。以pEGFprase20为模板，pCR扩增EGFPrascZO片段并常规克隆到peDNA3一IRES载体Notl/xbal酶切位点，经酶切及测序鉴定重组载体pZX的构建。针对pZX多克隆位点进行改建，我们在BamHI酶切位点插人了杂交后的双链寡核昔酸片段，为pzx载体添加了EcoRI和EcoRV两个酶切位点，提高了克隆外源片断的灵活性，为未来重组不同的目的基因提供了便捷。 4.DOC一IR基因表达对于DNA复制影响的研究 以pFLAG一DOC一IR载体转染Heu细胞，转染结束后继续培养过夜。以含有20协扩nilB记U的培养液培养lh后，进行间接免疫荧光染色。观察DOC一IR表达（FITC着色）的细胞中的DNA复制（罗丹明着色）情况，并与FITC未着色的细胞DNA.复制情况进行对比，通过统计学处理判断实验数据的意义。 5 .DOC一IR基因表达对于中心体复制影响的研究 以pFLAG-CMv一BAP、pFLAG一DOC一IR载体分别转染CHO细胞，转染结束后使用含有4mM HU的培养液进行细胞周期同步化培养，40h后进行间接免疫荧光染色分析。以转染pFLAG一CMV一BAP载体的细胞为对照组，转染pFLAG一DOC一IR载体的细胞为实验组，计数在转染基因表达（FITC着色）的情况下实验组与对照组中复制中心体（罗丹明着色）的细胞数目与未进行中心体复制的细胞数目（中心体数目）2认为中心体进行了复制)，并进行xZ检验，以判断实验数据的意义。实验结果 1 .pEeFP一eDKZ、pEGFP一CDKZN和pEGFP一CDKZC重组载体的构建 以限制性内切酶Hind班和BalrlHI对重组载体进行消化，从而对重组载体进行鉴定。当有目的基因片段插人时，pEGFP一CDKZ载体可以被消化为两条约为0.gkb和4.skb的片段，pEGFP一CDKZN和pEGFP一CDKZC分别可以被消化为两条约为0.6kb和4.，skb的片段。电泳结果与预期结果完全一致。DNA测序结果表明，野生型及两种缺失型CDKZ基因的序列及开放阅读框架完全正确，且与EGFP形成融合基因。将含有野生型CDKZ基因的载体命名为pEGFP一CDKZ，缺失C端97个氨基酸和N端97个氨基酸的重组载体分别命名为pEGFP一CDKZN和pEGFP一CDKZC。 2 .CDKZ蛋白质分子结构与其人核转运过程关系的初步分析 HeLa细胞与CHO细胞经过细胞周期同步化后，在荧光显微镜下观察绿色荧光在细胞内的分布。经转染pEGFP一CDKZ的细胞绿色荧光呈弥