研究背景和目的结直肠癌(colorectal cancer, CRC)是一种常见的严重危害人类健康的消化系统恶性肿瘤。在我国常见恶性肿瘤死因顺位排名中,结直肠癌位于第三位,其中在男性肿瘤患者中排名第四,在女性肿瘤患者中排名第三。随着我国经济的发展和人们生活水平的提高,人们饮食构成与生活习惯发生了较大的改变,结直肠癌发病率在逐渐增加,并且其发病年龄明显提前,其中30至40岁的中青年结直肠癌的发病比例上升最快。尽管现在结直肠癌诊断和治疗水平都有大幅提升,但死亡率仍然没有明显下降。转移是导致结直肠癌患者死亡的主要原因。临床上有一半以上的患者在行根治性手术之前就已经出现了微转移,它是导致结直肠癌患者术后复发和转移的直接原因。因此,深入结直肠癌发生发展过程的基础研究,全面认识结直肠癌发生转移的分子机制,寻找有效的、特异的转移相关基因,不仅对于结直肠癌的早期诊断、预后判断具有非常重要的价值,对于有效地改善结直肠癌患者的治疗效果,减少结直肠癌患者的死亡率同样具有重要的科学意义。TUSC3(tumor suppressor candidate 3)基因,也叫作N33、OST3A,位于人类第8号染色体短臂8p22。该基因全长224 kbp,含有11个外显子,在启动子和第一外显子区存在一个CpG岛。TUSC3蛋白含有348个氨基酸,4个跨膜结构域,还有1个N末端信号肽在蛋白成熟过程中被剪切(http://www.cbs.dtu.dk/services/signalP).TUSC3定位于内质网,它是寡糖转移酶复合物中的一个亚基,具有氧化还原酶的活性,在催化蛋白质N端糖基化的过程中起着非常重要的作用。因此TUSC3的异常可引起N糖基化进程的改变,而N糖基化与肿瘤的发生及演进(侵袭和转移)密切相关。此外,TUSC3还是细胞膜表面Mg2+转运不可或缺的成员,敲除该基因的表达可引起细胞内总Mg2+浓度和游离Mg2+浓度的降低,从而影响Mg2+的吸收并导致斑马鱼发育阻滞。迄今关于TUSC3在结直肠癌中的研究主要集中于启动子的甲基化研究,而没有TUSC3的表达分析或功能研究。因此,TUSC3在结直肠癌发生及转移中究竟起着什么样的作用?它通过何种分子机制或信号通路参与结直肠癌的发生发展?这些都值得我们进一步深入研究与探讨。通过本研究,我们将揭示TUSC3在结直肠癌发生和转移中的作用及其分子机制,探讨TUSC3在此过程中可能涉及的信号通路,进一步证实TUSC3作为结直肠癌发生及转移关键基因的设想,为寻找结直肠癌的潜在治疗靶点提供实验依据,为结直肠癌发生发展的分子机制提供新的理论。方法从临床病理分析、细胞功能实验与信号通路三个主要方面对TUSC3在结直肠癌发生、发展中的作用及分子机制进行具体研究。1、TUSC3在结直肠癌细胞系、组织中的表达及其临床意义利用免疫组化技术检测TUSC3在120例结直肠癌组织与癌旁组织中的表达水平,并分析TUSC3表达差异与病人年龄、性别、TNM分期、分化程度等临床病理特征的关系。同时,用western blot方法检测TUSC3蛋白在20例结直肠癌组织与癌旁组织中的表达量,用qRT-PCR技术检测TUSC3的mRNA在10例结直肠癌组织与癌旁组织中的表达量,明确结直肠癌与癌旁组织中TUSC3蛋白水平和mRNA水平的表达差异。采用qRT-PCR技术检测TUSC3在8个结直肠癌细胞株的表达水平,筛选出TUSC3表达量相对较高和相对较低的细胞株各两株。2. TUSC3在结直肠癌细胞株中的表达与细胞功能分析首先,构建TUSC3基因过表达的质粒并进行病毒包装。其次,设计并合成3个针对TUSC3基因的shRNA片段,筛选出干扰效率最高的一个,并对表达量较高的两株细胞株进行沉默处理,对表达量较低的两株细胞株进行过表达处理,以空病毒载体转染后的细胞株为对照组,并通过western blot与qRT-PCR方法确定转染效率与表达水平的变化。然后,采用细胞增殖实验(MTT分析)检测TUSC3过表达、沉默处理后的细胞增殖能力；采用小室侵袭实验检测TUSC3过表达、沉默处理后的细胞侵袭能力；采用划痕愈合实验检测过表达、沉默处理后的细胞愈合能力；采用平板克隆实验检测TUSC3过表达、沉默处理后的克隆形成能力：采用裸鼠皮下成瘤实验检测TUSC3过表达、沉默处理后结直肠癌细胞在动物体内的成瘤能力和增殖能力。3、TUSC3在结直肠癌发生、发展中作用的分子机制研究TUSC3涉及激活PI3K/Akt、MAPK以及Wnt/β-catenin信号通路促进结直肠癌细胞的EMT,通过western blot方法检测TUSC3过表达、沉默处理后的结直肠癌细胞内相关蛋白表达差异,明确TUSC3与PI3K/Akt、MAPK、以及Wnt/β-catenin信号通路之间的初步关系。4、统计学分析各组实验结果用SPSS软件进行数据分析,以p<0.05认为差异有统计学意义。结果1、TUSC3在结直肠癌组织中的表达及与临床病理因素的相关性分析定量real-time PCR和western blot结果显示,在随机选取的10对配对结直肠癌及癌旁组织中,TUSC3 mRNA在结直肠癌组织中的表达水平高于癌旁组织。在随机选取的20对配对结直肠癌及癌旁活检组织中,TUSC3蛋白在癌组织中的表达水平高于癌旁组织。免疫组化结果显示,TUSC3在120例结直肠癌组织中的阳性表达率为79.17%(95/120),而在癌旁组织中的阳性表达率为15%(18/120),可见TUSC3在癌组织中的阳性表达率高于癌旁正常组织(p<0.05)。统计分析发现,在结直肠癌患者中,TUSC3的表达与结直肠癌的Dukes分期、原发灶大小与范围、淋巴结转移、远处转移显著正相关(p<0.05)。但TUSC3的表达水平与年龄、性别、组织学类型、病理分级之间无相关性(p>0.05)。2、TUSC3在结直肠癌细胞株中的表达水平检测定量real-time PCR和western blot结果显示,结直肠癌细胞株HCT116、 LS174T、KO、LOVO、SW480、HT29、SW620和M5中TUSC3在转录和翻译水平有不同程度的表达,其中LS174T和HCT116细胞中TUSC3在转录和翻译水平中表达较低,而在SW480和HT29细胞中TUSC3表达较高。3、外源性高表达TUSC3增强LS174T、HCT116细胞的生长增殖和侵袭迁移能力用逆转录病毒感染的方法将TUSC3稳定表达于结直肠癌细胞株LS174T和HCT116中,经嘌呤霉素筛选并鉴定,得到稳定过表达TUSC3的细胞株LS174T-TUSC3和HCT116-TUSC3。MTT细胞增殖实验、平板克隆形成实验显示,与对照组相比,LS174T-TUSC3和HCT116-TUSC3细胞的体外增殖能力显著升高(p<0.05)。Transwell侵袭小室实验和划痕愈合实验证明,LS174T-TUSC3和HCT116-TUSC3细胞的体外侵袭迁移能力显著增强(p<0.05)。裸鼠皮下成瘤实验结果表明TUSC3过表达增强了LS174T细胞的体内成瘤能力(p<0.05)。4、沉默内源性TUSC3表达降低SW480、HT29细胞的生长增殖和侵袭迁移能力用逆转录病毒介导的方法构建稳定沉默内源性TUSC3表达的细胞株SW480-shRNA-TUSC3和HT29-shRNA-TUSC3。MTT细胞增殖实验、平板克隆形成实验显示,与对照组相比,SW480-shRNA-TUSC3和HT29-shRNA-TUSC3细胞的体外增殖能力显著降低(p<0.05)。 Transwell侵袭小室实验和划痕愈合实验证明,SW480-shRNA-TUSC3和HT29-shRNA-TUSC3细胞的体外侵袭迁移能力显著降低(p<0.05)。裸鼠皮下成瘤实验结果表明沉默TUSC3表达降低了SW480细胞的体内成瘤能力(p<0.05)。5、TUSC3促进结直肠癌进展的分子机制研究在传代培养过程中,显微镜下观察到LS174T-TUSC3细胞在形态上发生了上皮间质转化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)的改变。进一步采用western blot检测EMT相关分子标志物的表达,发现与对照组LS174T-NC细胞相比,LS174T-TUSC3细胞中上皮分子标志物E-Cadherin表达下降,而间质分子标志物Vimentin表达升高。用western blot方法检测TUSC3转染后实验组细胞模型和对照组细胞模型中PI3K/Akt、MAPK和Wnt/β-catenin信号通路中相关分子标志物的变化,发现TUSC3过表达的细胞中β-catenin的表达水平上升而GSK3β的表达水平下降,相反地,TUSC3沉默则导致P-catenin的表达水平下降而GSK3β的表达水平上升。免疫共沉淀分析显示TUSC3能与P-catenin具有相互作用关系。此外,与对照组细胞LS174T-NC相比,TUSC3过表达的细胞LS174T-TUSC3中p-AKT、 p-ERK1/2表达升高,与对照组细胞SW480-NC相比,TUSC3沉默表达的细胞SW480-shRNA-TUSC3中p-AKT、p-ERK1/2表达降低；而总AKT、ERK1/2表达均无明显变化。进一步采用western blot检测EMT相关分子标志物的表达,发现与对照组细胞LS174T-NC相比,LS174T-TUSC3细胞中上皮分子标志物E-Cadherin表达下降。以上结果说明TUSC3可激活PI3K/AKT、MAPK信号通路,降低E-Cadherin的表达量,升高Vimentin的表达量,从而引起结直肠癌细胞发生EMT转变,促进结直肠癌细胞的侵袭转移能力。结论TUSC3具有促进结直肠癌侵袭和转移的能力,并很可能通过PI3K/Akt、 MAPK信号通路、以及经典Wnt/β-catenin信号通路促进结直肠癌细胞EMT和侵袭转移,TUSC3有望成为判断结直肠癌患者进展及预后的一个新分子标志物,为结直肠癌的治疗提供新的分子靶点。本研究的创新之处1、从临床组织标本、细胞和动物模型中阐明TUSC3具有促进结直肠癌增殖和侵袭转移的作用；2、从细胞模型和分子水平初步揭示TUSC3可通过PI3K/Akt、 MAPK以及经典Wnt/β-catenin等信号通路,诱导EMT发生,从而促进结直肠癌进展。