神经干细胞（Neural stem cells, NSCs）是存在于胚胎期神经系统和成体脑组织中的一类具有自我更新和分化成神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞能力的干细胞。神经干细胞不仅对胚胎神经系统发育至关重要，也为各种中枢神经系统的损伤和疾病的治疗带来了希望。通过移植神经干细胞可以在动物或人体中治疗帕金森病、亨廷顿舞蹈症、肌萎缩侧索硬化症、阿兹海默症、多发性硬化症、中风和脊髓损伤等神经系统疾病。目前，神经干细胞的体外培养和扩增通常是在常氧即20%的氧浓度条件下进行的，而胚胎发育和成体脑组织中的氧浓度只有3-5%，甚至更低，这种现象被称作生理性低氧。近年来，越来越多的实验证据表明低氧对于神经干细胞的增殖和分化具有重要的调节作用。本实验室的研究结果表明，适度低氧能促进成年动物脑内和离体培养神经干细胞的增殖和分化。因此，研究低氧对神经干细胞存活、增殖和分化的调控具有重要的意义。低氧诱导因子（Hypoxia-inducible factor, HIF）作为细胞和分子水平的低氧感知分子是低氧信号通路中关键的调控分子之一。低氧条件下，细胞中的HIF-1α稳定并转移至细胞核，通过与低氧反应元件（Hypoxia responsive element, HRE）结合调控多种下游靶基因的表达，从而调控细胞存活、增殖和分化等生物学过程。最新的研究发现microRNAs参与HIF信号通路的调控。低氧下HIF-1α能上调多种miRNAs的表达如miR-23，miR-24，miR-26，miR-107，miR-210和miR-373等，而miR-199和miR-20b则能调控HIF-1α的表达。miR-210在现有报道的所有低氧处理的细胞中均一致表达上调，而且上调最为显著，被认为是低氧标志性microRNA。现有研究证明HIF-1能够与miR-210转录起始位点上游40bp处的低氧反应元件结合，进而调控miR-210的表达。miR-210通过其靶基因参与对细胞存活、凋亡、线粒体代谢、DNA损伤修复和血管生成等生物学过程的调控。然而， miR-210在神经干细胞中的表达及调节机制尚未见报道。因此，在该研究中我们探讨了低氧对神经干细胞中miR-210的表达调控和作用机制。主要研究结果如下：一、低氧对神经干细胞中miR-210的表达调控及功能研究1.将离体NSCs置于三个氧浓度下培养1、2、3天，然后用Realtime-PCR检测NSCs中miR-210表达量，发现3%和0.3%低氧能显著促进NSCs中miR-210的表达，并且随着低氧时间的延长和氧浓度的降低miR-210的表达量逐渐增高，提示miR-210在NSCs中可能具有重要的生物学作用。2.用DNA甲基化抑制剂AZA抑制DNA甲基化，能在常氧（20%）和低氧（3%，0.3%）下显著上调NSCs中miR-210的表达，说明DNA甲基化可能参与了miR-210的表达调控，而且这一调控通路不依赖HIF-1通路。3.通过在神经干细胞中过表达或抑制miR-210然后检测其对细胞存活、凋亡和增殖的影响，结果显示miR-210可以显著抑制缺氧（0.3%）引起的细胞凋亡，促进细胞存活，而不影响细胞增殖。4.为了进一步探讨miR-210作用的分子机制，通过生物信息学筛选与细胞存活和凋亡相关的靶基因，发现促凋亡蛋白BNIP3的编码区和3’UTR有两个可以和miR-210结合的种子序列，可能是miR-210的靶基因。5.通过过表达和抑制miR-210，发现miR-210能显著抑制BNIP3蛋白的表达。将BNIP3mRNA编码区和3’UTR的两个可能与miR-210结合的互补位点构建到荧光素酶报告载体，发现过表达miR-210能显著抑制这两个质粒的荧光素酶活性，而将这两个位点突变后能反转miR-210的抑制作用，说明BNIP3是miR-210的靶基因。6.通过BNIP3siRNA特异抑制BNIP3能显著减少低氧下miR-210inhibitor导致的细胞凋亡，说明miR-210—BNIP3在低氧下NSCs中发挥了关键的抗凋亡作用。7.通过核浆分离Western Blot和免疫荧光实验证明miR-210能够抑制促凋亡蛋白AIF入核，进而抑制了缺氧下神经干细胞的凋亡。二、低氧对循环miR-210的分泌调控及其初步的功能研究最新的研究发现miRNAs可以被细胞分泌到胞外，进入细胞培养液和体液循环系统。这种被膜结构和蛋白包裹的分泌形式的miRNAs被称为循环miRNAs。由于血浆中的循环miRNA具有稳定、易于获得和便于检测的特点，使其成为理想的疾病诊断的标志分子而受到广泛的专注。然而，循环miRNAs的功能研究目前少有报道。在此，我们观察了低氧处理神经干细胞后对循环miR-210分泌的影响和循环miR-210对神经干细胞存活的作用。1.通过Realtime-PCR检测三种氧浓度下NSCs培养了不同时间后，NSCs中和其培养液中miR-210的含量，结果显示低氧在促进NSCs中miR-210表达的同时，NSCs培养液中循环miR-210的含量也显著上调，并且具有氧浓度和低氧时间依赖性。2.通过超速离心的方法分离了含有循环miR-210的外来体（exosomes）和微囊（microvesicles），并用电镜观察了exosomes的超微结构。荧光染料特异染色实验表明外来体和微囊可以被受体细胞吸收。囊泡中的循环miR-210可以进入受体细胞，上调细胞中miR-210含量。3.将三种氧浓度下收集的NSCs培养液作用于常氧下的NSCs，并检测细胞存活发现3%氧浓度下的NSCs培养液能促进NSCs存活，而0.3%氧浓度下的NSCs培养液能抑制NSCs存活，在两种培养液中加入miR-210antagomir能反转循环miR-210对细胞存活的作用，说明NSCs培养液中含有的循环miR-210可以调节细胞存活。4.将含有梯度浓度循环miR-210的培养液作用于常氧下的NSCs，并检测细胞存活发现，循环miR-210对细胞存活的作用与其浓度有关，高浓度的循环miR-210对NSCs的存活有抑制作用，而低浓度的循环miR-210对NSCs存活的作用还需要进一步验证。5.将SD大鼠进行模拟高原5000米低压低氧处理0.5-2小时，然后通过Realtime-PCR检测大鼠血浆和脑脊液中miR-210的含量，结果表明低压低氧能显著促进大鼠血浆和脑脊液中循环miR-210含量增加。因此，血浆中循环miR-210的增加有可能作为高原低氧的标志分子，其具体作用和机制尚待进一步研究。综上所述，本研究发现：（1）低氧能显著上调NSCs中miR-210的表达量；（2）DNA甲基化参与调控miR-210的表达，并且独立于HIF-1通路；（3）低氧下miR-210具有促进NSCs存活，抑制细胞凋亡的作用；（4）BNIP3是miR-210的靶基因，miR-210通过抑制BNIP3的表达，进而抑制AIF入核，最终抑制了缺氧时NSCs的凋亡；（5）低氧能促进神经干细胞分泌miR-210；（6）循环miR-210可以影响NSCs存活，而且循环miR-210对NSCs存活的作用与其浓度有关；（7）低氧能促进大鼠血液和脑脊液中循环miR-210含量增加。以上的研究结果表明miR-210在低氧调节神经干细胞的存活和凋亡中具有重要的平衡作用；而循环miR-210不但是低氧的标志分子，而且参与对神经干细胞存活的调节。该研究也为神经发育的调控和神经干细胞的移植治疗神经损伤和神经退行疾病提供了新的理论基础和思路。