糖尿病是一种对人类健康有严重危害的代谢性疾病，而胰岛β细胞的凋亡是1型和2型糖尿病发病机制的重要环节。我们前期的研究表明，孤核受体NR4A1能够抵抗由氧自由基(ROS)或氧化应激所引起的胰岛β细胞凋亡。谷胱甘肽过氧化物酶1(GPX1)，作为谷胱甘肽过氧化物酶类中最多见的抗氧化酶，在抵抗由氧自由基(ROS)或氧化应激引起的细胞凋亡方面发挥十分重要的作用。因此，孤核受体NR4A1是否通过调控GPX1的表达来抵抗胰岛β细胞凋亡及相应的分子机制有待探索。本研究中，在构建过表达NR4A1的胰岛β细胞(MIN6)的基础上，用不同的方法检测GPX1的表达变化，并使用萤火虫酶检测NR4A1对GPX1启动子活性的影响及其作用方式。然后，在过表达GPX1的MIN6细胞中，用H2O2进行不同方式的处理，来模拟细胞所处的氧化应激状态，检测氧化应激状态下活化的Caspase3的水平变化。结果显示:在MIN6细胞中，过表达NR4A1能够使GPX1的表达量升高，双荧光素酶实验结果显示:NR4A1能够提高GPX1启动子的转录活性。经检索发现在GPX1启动子上（-273至-268）含有NR4A1的潜在结合位点。ChIP实验显示:NR4A1能够与该序列区域发生物理结合。初步研究提示:在MIN6细胞中过表达GPX1能够降低H2O2所致Caspase3活性形式水平的提高。综上所述，NR4A1具有通过增强GPX1的表达来抵抗氧化应激所引起的胰岛β细胞凋亡的潜在功能。　　研究目的:　　研究孤核受体NR4A1调控谷胱甘肽过氧化物酶1(GPX1)的表达及相应的分子机制。　　研究方法:　　1.培养过表达NR4A1的MIN6细胞及其对照细胞，分别记为OV细胞和NC细胞，收集细胞并提取蛋白进行Western Blot分析，验证OV细胞过表达效率。　　2.对等条件下平行培养的NC、OV细胞，进行cDNA芯片分析，即cDNA Microarray分析，筛选差异表达的基因。　　3.提取NC、OV细胞中的蛋白及mRNA，进行Western Blot及qPCR检测分析，以验证Microarray的结果。　　4.使用双荧光素酶检测实验测定NR4A1对GPX1启动子活性的影响。通过检索Ensenble数据库，查找GPX1启动子序列，利用体外重组的方法构建包含GPX1启动子上游2000bp序列及4000bp序列的荧光素酶报告基因，将含有不同长度启动子的报告基因的质粒分别与海肾荧光素酶质粒共转染到NC及OV细胞内，检测荧光素酶活性，从而检测NR4A1对GPX1启动子活性的影响。　　5.通过软件预测GPX1启动子上可能存在的NR4A1的结合位点，用Ad-NR4A1-HA（可表达带有HA标签的NR4A1腺病毒）和Ad-GFP（对照腺病毒）分别感染MIN6细胞，对其样品进行处理后用HA的特异性抗体再进行染色质免疫共沉淀(ChIP)实验，以沉淀并富集能与NR4A1蛋白结合的基因片段，再对沉淀的基因片段进行PCR扩增，来观察GPX1调控区中NR4A1结合位点的存在情况。　　6.用过表达GPX1的慢病毒及其对照病毒感染MIN6细胞，筛选出稳定过表达GPX1的细胞克隆（OV-GPX1细胞）及其对照细胞克隆（CON细胞），分别提取CON与OV-GPX1细胞的蛋白及mRNA，检测GPX1的过表达效果。　　7.用不同浓度的H2O2（0μM、100μM、200μM、400μM、600μM）分别处理CON细胞及OV-GPX1细胞12h，收集样品并提取蛋白;用100μM H2O2处理CON细胞及OV-GPX1细胞，在不同时间点(0h、1h、3h、6h、9h、12h)收集样品并提取蛋白。对蛋白样品进行Western Blot检测，分析细胞凋亡标志分子Caspase3（活化形式）的表达变化。　　研究结果:　　1.通过提取NC、OV细胞的蛋白质，经Western Blot检测结果显示OV细胞中的NR4A1表达水平显著高于NC细胞。　　2.cDNA Microarray结果显示，在MIN6细胞中过表达NR4A1之后，细胞中与氧化应激、凋亡等相关的基因，包括SOD2、BIRC5、BCL2、GPX1、CAT的表达均有差异，而其中GPX1的表达量差异最为显著，即过表达NR4A1之后，GPX1表达量显著升高。　　3.对NC、OV细胞中的GPX1表达进行蛋白水平及mRNA水平的检测，实验表明，OV细胞中GPX1的二者表达量与NC细胞中相比都显著升高，其结果与cDNA Microarray结果一致。　　4.经测序证实成功构建包含GPX1启动子上游2000bp序列及4000bp序列的荧光素酶报告基因，双荧光素酶实验结果显示，过表达NR4A1使得GPX1启动子2000bp长度和4000bp长度的转录活性均显著增强，相对于4000bp长度的GPX1启动子，过表达NR4A1对于2000bp长度的GPX1启动子转录活性增强不低于4000bp长度启动子的转录活性，提示NR4A1发挥效应的区域主要在0到-2000bp内。　　5.通过对GPX1启动子序列进行分析发现，在4000bp长度的启动子上存在三个NR4A1的潜在结合位点(TGACCT)，考虑到NR4A1对两个长度的GPX1转录活性的影响，我们推测，NR4A1的作用应当发生在0-2000bp内，潜在结合位点是-273至-268。经ChIP分析，首先选取此NR4A1潜在结合位点设计引物，进行PCR扩增。最终实验结果显示，过表达NR4A1能够将包含该潜在结合位点的片段扩增富集下来，而对照组无片段富集。说明NR4A1能够与GPX1启动子上的该潜在结合位点发生物理性结合。　　6.对CON、OV-GPX1细胞中的GPX1表达进行蛋白水平及mRNA水平检测，结果显示，无论是蛋白水平还是mRNA水平，OV-GPX1细胞中GPX1表达量均显著高于CON细胞，表明构建过表达GPX1的MIN6细胞株已经成功。　　7.Western Blot结果显示，随着H2O2浓度的升高，CON、OV-GPX1细胞中Caspase3的表达量也随之升高，但OV-GPX1细胞在不同浓度H2O2(0μM、100μM、200μM)处理时其活性形式的Caspase3水平的升高程度显著低于CON细胞。当H2O2浓度过高达到400μM以上时，细胞趋于死亡，表观上看可检测到的Caspase3的活性形式呈现降低，其实是细胞死亡所致总蛋白样品减少的结果。随着H2O2作用时间的延长，CON、OV-GPX1细胞中活性形式Caspase3的水平也随之升高，但OV-GPX1细胞在H2O2不同时间的处理过程中Caspase3活性形式的水平升高显著低于CON细胞。当作用时间过长，大约20h后，细胞趋于死亡，表观上看可检测到的Caspase3的活性形式呈现降低。　　研究结论:　　1.NR4A1通过改变胰岛β细胞MIN6中的GPX1启动子的转录活性而上调GPX1的表达，而NR4A1跟GPX1启动子上的潜在结合位点（-273至-268）有物理结合。　　2.过表达GPX1的MIN6细胞可抵抗H2O2所致的胰岛β细胞中caspase3活性形式水平的提高，提示NR4A1具有通过增强GPX1的表达来抵抗氧化应激所引起的胰岛β细胞凋亡的潜在功能。