论文部分内容阅读
原始卵泡的形成涉及复杂的生殖细胞-体细胞互作，本实验利用原始卵泡重构模型，研究了决定小鼠原始卵泡形成的重要因素及其作用的调控机制，结果表明：
经酶解离的小鼠胚胎卵巢细胞经体外培养可以重构形成原始卵泡。通过组织学及基因表达的分析，可以确定体外重构形成的原始卵泡具有典型的原始卵泡结构。正常的原始卵泡相关基因(Zp1-3，Figa，Cx43)的表达以及正常的原始卵泡发育能力，原始卵泡启动发育所必须的调控因子Gdf9，Bmp15和Fshr基因的表达都可以在体外培养的重构卵泡中检测到。
从13.5dpc起，胎鼠卵巢细胞开始具有体外重构形成原始卵泡的能力。12.5dpc胎鼠卵巢的生殖细胞可以在体外培养中发育为卵母细胞，但不能与此时的卵巢体细胞互作形成原始卵泡。通过对比原始卵泡相关基因在体外培养的13.5dpc和12.5dpc胎鼠卵巢细胞中的差异表达，得出Zp基因的正常表达决定卵母细胞在发育早期的分化，Figa基因的持续表达是决定原始卵泡能够在体外重构的必须因素。
利用上述胎鼠生殖细胞与体细胞之间细胞联系的分离和重构模型，我们随后研究了在体外重构形成转基因卵泡的可能性。转基因技术是研究基因功能的强有力的手段。然而对于卵母细胞而言，细胞分裂的特殊性和卵泡结构决定了到目前为止仍不能够将外源基因导入发育中的卵母细胞。本实验中，我们研究了将外源基因导入胎鼠卵巢生殖细胞的方法及可行性。选择从11.5dpc到15.5dpc，处于不同细胞分裂状态的胎鼠卵巢生殖细胞用于转染实验。研究发现，通常的传染方法：磷酸钙法和脂质体法均可以用于胎鼠卵巢生殖细胞的转染。脂质体法拥有较高的转染效率并且对细胞没有明显的伤害，但是在适当的转染液孵育时间内(3h)，虽然磷酸钙方法的转染效率较低，但其对细胞后续的发育能力保护更好一些。从13.5dpc起，当胎鼠卵巢生殖细胞开始进入减数分裂时，全部的胎鼠卵巢生殖细胞便失去整合外源基因的能力。在15.5dpc之前，尤其是在11.5～13.5dpc，外源基因在胎鼠卵巢生殖细胞中可表达，为在卵子发生早期阶段进行基因功能的研究提供了新的实验手段。
基于原始卵泡体外重构模型和卵原细胞转基因方法，我们进一步研究了在体外原始卵泡形成的过程中，生殖细胞与体细胞互作的机制。利用一系列的胎鼠卵巢细胞共培养，以及“互换、互作卵泡重构”实验。我们发现，原始卵泡形成的过程要求高度同步发育的生殖细胞—体细胞互作。同样具备卵泡重构能力的、不同胎龄的胎鼠卵巢生殖细胞和体细胞在体外互换、互作之后，正常的原始卵泡形成过程不能完成。在培养过程中，生殖细胞Figa基因的表达逐渐缺失，原始卵泡形成过程不能正常地进行，伴随着Bax基因的异常表达，生殖细胞将发生退化死亡。
原始卵泡形成时生殖细胞将发生大量的凋亡而体细胞则处于细胞分裂的抑制状态。因此，基于上述胎鼠卵巢中细胞数量控制的现象可能对原始卵泡库建立时卵泡的数量起调控作用的猜测，在本实验中，利用原始卵泡重构模型，我们研究了生殖细胞与体细胞的数量对重构形成原始卵泡数量的作用。结果发现，增加生殖细胞或体细胞的数量，并不会促进重构原始卵泡数量的增加，相反会导致体细胞出现异常增殖生长，生殖细胞不能最终分化为健康的卵母细胞，进而最终导致正常的原始卵泡形成过程不能发生。由此可见，原始卵泡的形成过程存在精确控制的生殖细胞—体细胞数量的平衡，该平衡的破坏可导致原始卵泡形成的失败。
由于前人和我们现有的研究发现Figa基因是形成原始卵泡的必须因素，于是通过原位杂交技术及Tunel凋亡检测，我们研究了Figa基因在1dpp小鼠卵巢中的表达及其与原始卵泡形成时生殖细胞的选择和生殖细胞凋亡的关系。研究发现，Figa基因在1dpp小鼠卵巢中的表达存在生殖细胞间的差异，即同时存在Figa基因表达的阳性和阴性生殖细胞，这种Figa基因在生殖细胞间的差异表达在原始卵泡形成前的17.5dpc胎鼠卵巢中即可以检测到。Figa基因在1dpp小鼠卵巢生殖细胞间的差异表达可能与原始卵泡形成时卵母细胞的选择有关。同时，由于凋亡的生殖细胞中也可以检测Figa基因的表达，因此Figa基因在1dpp小鼠卵巢中的差异表达可能并不决定此时卵巢中的生殖细胞凋亡。
中肾组织对胚胎卵巢分化和发育的作用目前尚未明确，而12.5dpc是胎鼠卵巢分化的关键时期。因此在本实验中我们研究了12.5dpc的中肾组织对此时的胎鼠卵巢细胞体外分化发育的影响。结果发现，中肾细胞并不能促进12.5dpc胎鼠卵巢细胞在体外培养中获得体外重构形成原始卵泡的能力。在无血清组织培养体系下，12.5dpc胎鼠卵巢自身可进行卵巢细胞的分化并形成原始卵泡。而在该培养条件下，中肾组织的存在会导致卵巢细胞的正常分化受到抑制，这主要表现为体细胞未能完成前颗粒细胞的分化，卵母细胞未能形成原始卵泡并完成最终分化。即在12.5dpc胚胎小鼠中，中肾组织对卵巢的分化具有作用，其作用的方向可能依赖于某些未知的因子和激素的存在。
连接蛋白被认为对卵泡发育过程中的细胞间互作和信号传递具有重要的意义。在本实验中，利用免疫组织化学技术，我们系统的研究了在小鼠胚胎卵巢发育过程中连接蛋白26(Cx26)的表达情况。研究发现，Cx26在胚胎卵巢发育的早期即可检测到，并且在生殖细胞之间存在差异表达。在大量卵泡形成启动前(18.5dpc)Cx26在生殖细胞之间的差异表达可能与原始卵泡形成的启动机制有关。而在原始卵泡形成时(1dpp)，Cx26在原始卵泡中生殖细胞的差异表达提示其可能并不参与原始卵泡形成时生殖细胞的选择。Cx26在原始卵泡库建立后直到性成熟卵巢中仅表达于卵母细胞和卵泡膜细胞的现象提示Cx26可能参与原始卵泡库的最终建立。
综上所述，本论文通过对原始卵泡形成时生殖细胞-体细胞间互作(发育阶段，细胞数量)，Figa基因和Cx26蛋白的表达，中肾组织对卵巢分化作用的研究，我们对小鼠原始卵泡形成机制做了初步的探讨和研究。