第一部分:MMP-9、MMP-2及TIMP-1在慢性鼻窦炎伴鼻息肉组织中的表达及其作用机制[目的]初步在100例慢性鼻窦炎伴鼻息肉（CRSwNP）患者鼻黏膜组织中明确MMP-9,MMP-2和TIMP-1的蛋白表达相互关系,再进一步取慢性鼻窦炎伴鼻息肉（CRSwNP）组织和正常对照鼻黏膜组织,确定两者间在MMP-9,MMP-2和TIMP-1的蛋白表达差异,探讨MMP-9,MMP-2及TIMP-1在CRSwNP中的相关性。[方法]实验收集2018年7月至2019年6月在昆明医科大学第一附属医院耳鼻喉1科行功能性内窥镜鼻窦手术患者的鼻腔息肉组织标本100例。以Western-blot检测以上病变鼻黏膜组织和正常鼻黏膜组织中MMP-9、MMP-2、TIMP-1蛋白表达水平,并初步分析MMP-9与TIMP-1,MMP-2和TIMP-1间在CRSwNP中蛋白表达相互关系。此外,以CRSwNP组织24例及对照组鼻黏膜组织7例行对照验证分析,明确及评价MMP-9,MMP-2和TIMP-1较正常水平,蛋白表达及三者相互关系的差异性和意义。并以免疫荧光染色分析这三类蛋白在CRSwNP与正常组织中的蛋白表达定位分布。HE染色对慢性鼻窦炎伴息肉组织的炎症病理改变与正常鼻黏膜组织进行对照观察分析。[结果]对比正常鼻黏膜（对照组）组织,在CRSwNP中,MMP-9,MMP-2的蛋白表达量明显增加（P＜0.01）,而TIMP-1的蛋白表达量则下降（P＜0.01）。TIMP-1 与 MMP-2（r=-0.4672）和 MMP-9（r=-0.4484）呈现中度负相关关系。免疫荧光显示对比正常鼻黏膜组织中MMP-2和MMP-9的表达,CRSwNP组织中的表达荧光强度显著升高（P＜0.01）,而TIMP-1的蛋白表达则显著降低（P＜0.01）,与此同时还发现三者在组织中的定位基本分布在上皮,基质层,腺体和血管中,HE染色可见到在CRSWNP组织基质层内高度水肿,大量囊泡样物堆积,腺体增生明显。基质中,血管内皮,基底膜和腺体周围都有大量炎症细胞浸润。[结论]1.MMP-9,MMP-2在CRSwNP患者的鼻黏膜组织中的蛋白表达水平明显升高,而TIMP-1的蛋白表达水平则下降。TIPM-1和MMP-9和MMP-2均呈负相关系。2.免疫荧光显示MMP-2,MMP-9和TIMP-1在正常鼻黏膜和CRSWNP组织中均有表达。但表达水平及定位不同。3.CRSWNP组织中有着基质水肿,腺体增生和炎症细胞浸润的典型组织重塑的病理组织结构特点。第二部分:miR-29b-3p对MMP-2,MMP-9的上游靶向作用关系验证及调控机制[目的]进一步明确CRSwNP中miR-29b对MMP-2和MMP-9蛋白的靶向调控作用。[方法]通过生物信息学的方法在GEO数据库对CRSWnp中差异表miRNA进行分析筛选,以RT-PCR检测CRSwNP与正常鼻黏膜组织中miR-29b-3p的表达水平差异,通过Target scan及starbase在线软件进行miRNA-mRNA对miR-29b-39与MMP-2及MMP-9的结合靶位点及初步靶向关系的预测,并通过双荧光素酶报告基因系统对miR-29b与MMP-9,MMP-2的靶向调控作用再次验证。将CRSwNP组织中经Westetn-blot蛋白水平检测筛选出MMP-9和MMP-2表达水平最高和最低的,定义为H-PHNEs和L-PHNES,行原代细胞培养。再将 miR-29b mimics 和 inhibitor 分别转染至 H-PHNEs 和 L-PHNES 细胞中,以Western-blot对转染后的H-PHNEs和L-PHNES细胞中的MMP-9,MMP-2的蛋白水平变化对比分析。[结果]miR-29b-3p在CRSwNP鼻黏膜组织中表达水平下调（P＜0.01）。双荧光素酶报告显示,miR-29b-3p mimics可显著降低MMP-9-WT（P＜0.01）及MMP-2-WT（P＜0.01）的相对荧光素酶活性,而对于MMP-9-MUT及MMP-2-MUT 没有影响（P＞0.05）。miR-29b-3p 抑制剂 miR-29b-3p inhibitor 转染 L-PHENS 后 MMP-9 及 MMP-2 的 mRNA 的表达水平升高（P＜0.05）。miR-29b-3p模拟物 miR-29b-3p mimicsr 转染 H-PHENS 后 MMP-9 及 MMP-2 的 mRNA 的表达水平下降（P＜0.05）。[结论]在CRSwNP中,miR-29b-3p是MMP-9和MMP-2上游调控的miRNA,miR-29b-3p 对 MMP-9 和 MM-P-2 有靶向负调控作用。CRSwNP 中MMP-9和MMP-2的高表达与上游调控的miR-29b-3p受被抑制有关。第三部分:MMP-9与intrgrin-β 1的互作致α-tubulin去乙酰化在鼻息肉发生发展中的意义及机制[目的]验证ingetrin-β1和α-tubulin是MMP-9在CRSwNP致病中的潜在相互作用蛋白,明确ingetrin-β1,α-tubulin和MMP-9三者的蛋白质互作关系及形成的蛋白质复合物在CRSwNP中的致病作用分子机制。[方法]以文献前期研究及string蛋白数据中进行MMP-9互作蛋白网络关系搜素,初步筛选MMP-9常见的互作蛋白integrin β1和α-tubulin蛋白,行CO-IP和GST-pulldown下拉试验,分别进行细胞内和细胞外的MMP-9,integrin-β1和α-tubulin蛋白结合关系验证及进一步明确相互间的间接或直接结合关系。并在培养的人鼻腔原代细胞中分别行miR-29b的功能增强和抑制试验,MMP-9的过表达和干预表达试验,以Western-blot和免疫荧光对以上各种干预处理后的integrin-β1和乙酰化的α-tubulin的蛋白表达水平及蛋白定位进行分析。验证及确定MMP-9,integrin-β1和α-tubulin三者的蛋白互作关系是存在于CRSwNP中,并共同受上游MiR-29b-3p的靶向调控。[结果]免疫共沉淀（CO-IP）显示integrin-β1和α-tubulin均可以与MMP-9结合。GST-pulldown下拉试验进一步明确了 MMP-9与integrin-β1是直接结合关系,而与α-tubulin不能直接结合,需要先与integrin-β1结合后,由integrin-β1介导才能与α-tubulin的结合。在高表达MMP-9的人鼻黏膜原代细胞中（H-PHNEs）进行miR-29b转染,行miR-29b的功能增强,乙酰化的微管蛋白（Ace-tubulin）的表达显著增加（P＜0.001）,而integrin-β1的蛋白水平无变化（P＞0.05）。相反,将miR-29b inhibitor转染入低表达MMP-9的人原代鼻粘膜细胞中（L-PHNEs）进行miR-29b的功能抑制试验后,乙酰化微管蛋白（Ace-tubulin）的表达水平显著下降（P＜0.001）,而integrin-β1的蛋白水平变化无统计学差异（P＞0.05）。进一步先以miR-29b mimics转染,再以OE-MMP-9质粒转染H-PHNEs后,随着MMP-9蛋白表达水平的先下降后提高,乙酰化的微管蛋白则出现先提高后下降。免疫荧光显示CRSWNP组织中乙酰化微管蛋白的水平较正常鼻黏膜组织降低,而整合素β1在CRSWNP组织和正常鼻黏膜组织中表达无统计学差异（P＞0.05）。[结论]1.在CRSwNP中,整合素-β1和α-微管蛋白是MMP-9的相互作用蛋白。整合素-β1和MMP-9是直接结合,α-微管蛋白与MMP-9的结合是通过integrin-β1介导后间接结合。2.整合素β1与α-微管蛋白结合后,α-微管蛋白乙酰化水平提高,而整合素-β1与MMP-9结合后再与α-微管蛋白结合,导致微管蛋白的乙酰化水平下降,去乙酰化的作用增强。3.去乙酰化的α-微管蛋白结构不稳定,易发生解聚致细胞骨架变形,增加鼻黏膜上皮细胞的间质转化倾向,内皮细胞通透性增加可能是CRSwNP组织重塑发生的重要环节。第四部分:miR29b-3p/MMP-9/α-tubulin轴在LPS诱导的N69细胞及小鼠鼻粘膜上皮细胞中炎症作用及鼻息肉形成的靶向调控作用验证[目的]通过脂多糖LPS诱导建立以中性粒细胞感染为主的CRS的人永生化鼻咽上皮细胞（NP69）细胞模型和CRSwNP小鼠模型。进一步在细胞实验和动物实验层面对CRSwNP中miR29b-3p靶向调控MMP-9引发MMP-9与integrinβ1和α-tubulin的蛋白互作关系,进而对CRSwNP分子病理过程产生了影响。[方法]LPS与NP69细胞共同孵育,构建LPS诱导的以激发中性粒细胞性炎症类型的NP69细胞模型,ELISA对NP69诱导后细胞因子1L-1β,IL-8,TNF-α的分泌水平进行检测,CCK-8和流式细胞学分别对NP69的炎症状态细胞进行细胞活力和细胞凋亡率的检测。LPS 10ug/对小鼠鼻腔连续灌洗,构建CRSwNP的小鼠动物模型,行小鼠鼻腔组织病理切片,HE染色观察炎症黏膜改变及息肉形成数量,RT-qPCR检测miR-29表达水平;WB检测MMP-9、Integrin、Ace-Tubulin 表达水平;免疫荧光确定 MMP-9、Integrin、Ace-Tubulin 表达水平;ELISA检测炎性因子IL-1、IL-6和TNF-α水平。[结果]LPS刺激诱导的NP69细胞炎症后,细胞中MMP-9表达水平显著增加（P＜0.001）,而乙酰化的α-tubulin则明显下降（P＜0.001）。当以miR-29 mimics增强miR-29b的功能后可部分逆转LPS的作用,MMP-9的表达可被降低,但不能回复正常水平。当先将miR-29b mimics,后以OE-MMP-9转染入LPS刺激的NP-69细胞后,OE-MMP-9可逆转miR-29b抑制炎症的作用,MMP-9和Ace-tubulin可基本回复至LPS刺激后的表达水平（P＜0.001）,si-MMP-9转染至炎症NP69细胞后,对炎症的抑制作用与miR-29b mimics相似（P＞0.05）。LPS诱导可使小鼠鼻黏膜慢性炎症状态及息肉形成,HE染色可显示鼻黏膜下间质层明显增厚,并伴有大量囊泡样物质形成,内有渗出液。部分黏膜表面向鼻腔面凸起如囊肿物,囊肿内富集渗出液及中性粒细胞,即为息肉组织。随着miR-29b-mimics和OE-MMP-9的转染干预,小鼠鼻黏膜的炎症状态也随之发生变化,miR-mimics使黏膜下间质层明显变薄,水肿减轻,囊泡样物吸收减少。鼻黏膜表面息肉数量减少。OE-MMP-9的干预后,炎症恢复,黏膜下渗出逐渐增加,间质层有增厚。免疫荧光染色,黏膜下间质层中分布红色荧光显色的MMP-9和绿色荧光显色的integrin-β,随着不同干预后的炎症状态变化,LPS时红色荧光的MMP-9分布最广,强度最大,miR-29-mimics使红色荧光范围减少,强度减弱,OE-MMP-9时红色荧光又增强及分布加大,而代表Integrin-β的绿色荧光则不会随干预的变化而发生改变。免疫荧光对立体细胞骨架蛋白结构不可显像,所以对α-tubulin仅进行了 Western-blot蛋白水平检测。Western-blot结果与免疫荧光结果相对应一致,ELISA检测IL-1,IL-6和TNF-α在LPS刺激后的鼻黏膜中分泌水平最高,而三类炎症因子中,IL-6增长最多,IL-1β相对分泌最少。miR-29bmimics抑制炎症后,炎症因子水平均降低。OE-MMP-9在miR-29b mimics抑制炎症后转染,逆转了抑制炎症作用,使得三类炎症因子分泌水平又再次升高。[结论]LPS刺激会诱导NP69细胞炎症的产生,炎症NP69细胞中MMP-9蛋白表达水平明显升高,而乙酰化微管蛋白的表达水平则相应下降,细胞活力下降,凋亡率增加。Lps诱导可构建类CRSwNP的理想动物模型。LPS刺激后,小鼠鼻黏膜炎症反应最明显,MMP-9的表达水平最高,乙酰化α-tubulin的表达最低,增强miR-29b-3p或MMP-9的表达可改变小鼠鼻黏膜炎症状态。在细胞实验和动物实验层面均能证明miR-29b-3p对MMP-9的靶向调控及MMP-9与integrin β1和α-tubulin蛋白互作关系对CRSwNP致病性的影响。