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口蹄疫(foot-and-mouth disease,FMD)是一种由口蹄疫病毒(foot-and-mouth disease virus,FMDV)引起的,具有高度传染性的,能在牛、猪、羊等偶蹄类动物中广泛传播的疾病。其临床症状表现为体质虚弱,以及蹄、下肢和口部水疱的形成,具有高发病率和低死亡率的特点,给养殖业带来严重的经济损失。FMDV感染宿主后能够逃避宿主免疫,其3C蛋白酶(3C proteinase,3Cpro)在其中发挥了重要作用,但具体机制还不是十分清楚。应激颗粒(stress granules,SGs)是真核细胞受环境刺激(包括病毒感染)时,蛋白翻译起始暂停,翻译起始复合物与核糖体40S亚基以及许多RNA结合蛋白在胞质中聚集形成的致密颗粒,是细胞应对环境刺激的一种保护性机制。许多研究表明,包括小RNA病毒在内的许多病毒在感染细胞后能以各种方式影响SGs的形成,同时细胞产生的SGs也能从不同层面影响病毒增殖。鉴于此,本课题以FMDV为对象,研究FMDV感染对SGs形成的影响及其分子机制。具体内容如下:1.FMDV不诱导SGs形成及3Cpro切割G3BP1以G3BP1作为SGs的生物标记,通过间接免疫荧光试验(IFA)分别检测FMDV感染和亚硝酸盐(Arsenite,ARS)处理的IBRS-2细胞中SGs的形成情况。结果显示,相比未处理组,ARS处理的IBRS-2细胞可以正常产生SGs,而FMDV感染不诱导SGs形成,且G3BP1含量显著下降,推测病毒蛋白酶有可能参与下调G3BP1的表达。将FMDV蛋白酶Lpro、3Cpro及其前体蛋白分别与G3BP1共转染HEK-293T细胞中,Western Blot检测G3BP1的表达情况。结果显示3Cpro及其前体蛋白可以切割G3BP1,且切割效应呈现剂量依赖性。2.FMDV3Cpro的蛋白酶活性参与切割G3BP1及抑制SGs的形成将3Cpro三个关键的蛋白酶活性位点分别进行突变,然后与G3BP1共转染293T细胞,Western Blot检测发现,蛋白酶活性突变的3Cpro不能切割G3BP1,说明3Cpro的蛋白酶活性参与切割G3BP1。进一步将3Cpro及蛋白酶活性突变体3CC163G分别转染293T细胞,ARS刺激后观察SGs的产生。通过IFA发现,超表达3Cpro的293T细胞没有SGs产生,而转染了3CC163G的细胞则能形成正常的SGs,表明3Cpro能够抑制SGs生成,且与其蛋白酶活性有关。此外,在添加蛋白酶体途径抑制剂MG-132或细胞凋亡抑制剂Z-VAD后,Western Blot仍然能够检测到3Cpro切割G3BP1,说明这种切割效应是特异性的,不依赖蛋白酶体及细胞凋亡途径。3.FMDV 3Cpro切割G3BP1的位点鉴定根据G3BP1切割条带大小及3Cpro的切割底物的特点,构建了一系列G3BP1的位点突变体。通过Western Blot检测发现,将G3BP1第284位谷氨酸(Glutamic acid,Glu)突变后,3Cpro不再切割G3BP1,说明切割位点在284位Glu。构建切割位点两端的截短突变体,并将两段截短突变体分别转染293T细胞,ARS刺激。间接免疫荧光检测发现,G3BP1被切割下来的两个截短突变体都无法聚集形成SGs。