目的:高磷是慢性肾脏病（chronic kidney disease，CKD）患者心血管事件十分重要的非传统危险因素，血管钙化的存在及其程度则是心血管事件的独立预测因子。而CKD患者的血管钙化以中膜的钙化为突出表现。血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells，VSMCs)是血管中膜最主要的细胞成分，其发生类成骨/成软骨样的表型转化是血管钙化的关键环节，其特点是出现骨源性基因的表达上调，尤其是核心结合因子a1(corebinding factor a1，Cbfa1)和性别决定区Y-box9(sex determine regionY-box9，Sox9)被视为表型转化的标志物，但关于其表型转化的具体方向尚未有明确定论。本研究旨在通过体外模拟高磷环境刺激大鼠VSMCs，观察表型转化相关基因表达的动态变化，进而探讨VSMCs的表型转化方向，为高磷诱导的CKD患者血管钙化发生机制的阐明和防治提供一定的理论基础。　　方法:　　1血管平滑肌细胞的培养与鉴定　　去除血管外膜及内膜后，采用组织块贴壁法对大鼠胸主动脉血管平滑肌细胞进行原代培养，使其经传代自然纯化，并通过形态学及免疫细胞化学的方法对其进行细胞鉴定。　　2实验分组及处理　　将生长状态良好的对数期VSMCs随机分为空白对照组、高磷组（HP组）及膦甲酸钠(phosphonoformic acid，PFA)组，空白对照组培养基为含10％胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）的低糖DMEM培养基，HP组为10％FBS+10 mmol/Lβ-甘油磷酸的高磷培养基，PFA组为10％FBS+10mmol/Lβ-甘油磷酸+1mmol/L PFA的PFA培养基，每24 h更换一次培养基。检测给予刺激后6h、12h、1d-5d中表型转化相关基因的动态表达情况。　　3高磷诱导后相关基因mRNA的表达情况　　应用反转录聚合酶链反应(RT-PCR)方法测定空白对照组及HP组不同时间点VSMCs中Cbfa1、Sox9、Ⅱ型胶原a1(typeⅡ collagen a1，ColⅡa1)、Ⅹ型胶原a1(typeⅩ collagen a1，ColⅩa1)mRNA的表达情况，以GADPH为内参，所有基因均采用同管扩增。　　4 HP组及PFA组Cbfa1的表达情况　　应用RT-PCR及Western blot法测定HP组及PFA组不同时间点VSMCs中Cbfa1在mRNA及蛋白水平的表达情况。　　5统计学方法　　应用SPSS13.0统计学软件对实验数据进行统计学分析，实验结果用均数±标准差（(x)±s）表示，两组间均数的比较采用t检验，多组间均数的比较采用单因素方差分析（ANOVA），多组间均数两两比较采用S-N-K检验(Student-Newman-Keuls，SNK)。以P＜0.05为差异有统计学意义。　　结果:　　1 VSMCs原代培养　　原代培养3d即可见组织块边缘有细胞爬出，约6～7 d后融合成片，即可传代。倒置相差显微镜检观察，细胞呈星型或不规则形，以梭形为主，可相互重叠生长，可见典型的束状排列和“峰-谷”样生长。HE染色:镜下可见细胞胞浆丰富，细胞核大，呈圆形或椭圆形，可见一个或多个核仁。免疫细胞化学法检测α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)，可见在细胞胞浆内有强阳性表达，免疫反应产物呈棕黄色，沿着细胞长轴呈细丝状排列，98％以上细胞可见强阳性表达。　　2 HP组表型转化相关基因mRNA的表达情况　　随着高磷诱导时间的延长，Cbfa1 mRNA的表达呈先上升、后下降、而后再次升高的趋势（P＜0.05），即其表达变化呈“峰-谷-峰”样，且分别于6h和3d达到峰值;而Sox9则仅在1d时达峰，呈“单峰”，且其达峰时间处于Cbfa1的谷值和第二峰值之间。而作为Sox9下游基因的Ⅱ型胶原a1的变化与之类似，呈“单峰”(P＜0.05);而作为Cbfa1下游基因以及肥厚软骨细胞标志物的X型胶原a1则在初期维持基础的低水平，而在Cbfa1第二次出现峰值后表达显著升高（P＜0.05）。　　3 HP组和PFA组Cbfa1 mRNA和蛋白的表达情况　　随着高磷刺激时间的延长，Cbfa1 mRNA和蛋白的表达均呈“双峰”样(P＜0.05)，分别于6h及3d达峰;而PFA组则表现为第二高峰前移，分别于6h及1d达峰(P＜0.05)，且第二峰值低于第一峰值(P＜0.05)。　　结论:　　1高磷刺激大鼠VSMCs后Cbfa1、Sox9及其下游基因mRNA的动态变化符合软骨细胞分化的特点，进而推测高磷可能诱导大鼠VSMCs发生了类似软骨细胞样的表型转化。　　2用PFA抑制大鼠VSMCs对磷的摄取后Cbfa1表达的第二高峰前移，可能对抑制VSMCs表型转化后的进一步分化起一定作用。