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第一部分文献研究目的:通过对近10年国内外文献研究,详细阐述卵巢功能减退(DOR)的因、机、诊、治及其研究进展,为临床诊治DOR和制定动物实验研究方案提供理论依据。方法:搜索中国知网与PUBMED近10年的国内外文献,从现代医学的角度详细阐述DOR的病名、流行病学、病因、病理生理、临床表现、诊断标准、治疗方法、卵巢功能的评估方法和DOR、卵巢早衰(POF)的动物模型;从中医角度详细阐述DOR的中医病名归属、病因病机、辨证论治。结果:DOR是一种病因病机复杂,临床表现高度特异质疾病。目前诊断标准与治疗方案尚未达成共识。年龄、AMH、AFC、INHB是评估卵巢功能非常有价值的指标。DOR的治疗与疗效评估是难点。因此,研究出临床疗效好、无副作用的治疗方案是临床最需要的。中医认为DOR的病机以肾虚为根本,兼有肝郁、脾虚、血瘀中的一项或者多项,临床以肾虚肝郁证居多。治疗以补肾疏肝、健脾活血为法。结论:DOR病因病机复杂,临床表现高度特异质。中医认为DOR的病机以肾虚为根本,兼有肝郁、脾虚、血瘀中的一项或者多项,涉及肾、肝、脾、心四脏。肾虚肝郁证是DOR临床最常见的证型。中医药治疗DOR具有独特的优势和特色,值得探索与研究。益经汤是清代傅青治疗月经后期、闭经的名方。第二部分加减益经汤对肾虚肝郁证DOR患者卵巢功能及TGF-β超家族相关成员的研究目的:通过对比人工周期疗法(AMCT),研究加减益经汤治疗肾虚肝郁证DOR的临床疗效及对转化生长因子-β (TGF-β)超家族相关成员的影响,阐述其疗效及可能的作用机理,为临床推广应用加减益经汤提供循证依据。方法:采用前瞻性随机对照的研究方法,将妇科门诊收集的肾虚肝郁证DOR病例67例,随机分为中药组(加减益经汤)33例和西药组(人工周期组)34例。中药加减益经汤组从月经干净第1天开始服用加减益经汤治疗3个月经周期(若超过40天月经未潮,则停服加减益经汤,改服地屈孕酮片20mg/d×10d),西药人工周期组从月经第5天开始服用补佳乐2mg/d+地屈孕酮20mg/d×10天治疗3个月经周期,对比两组治疗前后的中医证候积分、血清bFSH、bLH、bE2、AMH、TGF-β1、 BMP-15、血常规、肝肾功能、乳腺彩超。结果:(1)治疗前的基线资料比较:两组病例年龄分布、病程分布、月经与不孕情况分布无差异(p>0.05),二组资料具有可比性。(2)中医症状总积分比较:中、西药组治疗后中医症状总积分较治疗前显著降低(p<0.01);中药组的积分差值(治疗前-治疗后)较西药组显著降低(p<0.01)。(3)主要中医症状积分比较:中、西药组的“月经周期紊乱、月经量的改变、月经血质的改变”治疗后积分较治疗前积分显著降低(p<0.01)。中药组的“月经量的改变、月经血质的改变”积分差值较西药组显著升高(p<0.05);而西药组的“月经周期紊乱”积分差值较中药组显著升高(p<0.05)。中药组的“腰骶酸痛、胸胁、乳房胀痛”治疗后积分较治疗前显著降低(p<0.01),而西药组无差异(p>0.05)。中药组“腰骶酸痛、胸胁、乳房胀痛”的积分差值较西药组显著降低(p<0.01)。(4)次要中医症状积分比较:中药组“头晕耳鸣、性欲减退、神疲乏力、小腹胀痛、脘闷不舒伴叹息”治疗后积分较治疗前积分显著降低(p<0.01)。中药组这五个次要中医症状的积分差值较西药组显著降低(p<0.05)。西药组的“性欲减退、脘闷不舒伴叹息”治疗后积分较治疗前积分显著降低(p<0.05)。(5)血清bFSH、bLH、bE2的比较:中、西药组治疗后bFSH、bLH较治疗前显著降低(p<0.01);中、西药组治疗后bE2较治疗前显著升高(p<0.01)。中药组bFSH、 bLH、bE2差值较西药组无明显差异(p>0.05)。(6)血清AMH、BMP-15、TGF-β1的比较:中、西药组治疗后AMH、BMP-15较治疗前显著升高(p<0.01)、TGF-β1较治疗前无明显差异(p>0.05)。中药组治疗前后AMH、BMP-15、TGF-β1差值较西药组无明显差异(p>0.05)。(7)治疗前后AFC的比较:中、西药组治疗后AFC较治疗前明显升高(p<0.01);中药组AFC差值较西药组无明显差异(p>0.05)。(8)妊娠率比较:中药组的妊娠率较西药组无明显差异(P>0.05)。(9)综合疗效比较:中药组综合总有效率较西药组无明显差异(P>0.05);中药组的综合疗效较西药组无明显差异(P>0.05)。结论:(1)加减益经汤与人工周期疗法(补佳乐2mg/d×21d+地屈孕酮20mg/d×10d)是治疗肾虚肝郁证DOR患者的有效方法。两种治法综合疗效相当,可明显改善肾虚肝郁证DOR患者的卵巢储备功能,主要表现为:减轻患者临床症状,降低bFSH、bLH,升高bE2、AMH,增加AFC,升高BMP-15。加减益经汤在改善临床症状、增加妊娠率方面优于人工周期疗法。加减益经汤治疗肾虚肝郁证DOR患者疗效可能优于人工周期疗法,特别是对于有激素使用禁忌症和有生育要求的患者,加减益经汤是较好的选择。(2)加减益经汤改善临床症状、卵巢功能、增加妊娠率的可能作用机制:①具有多系统、多环节、多靶点的整体调节作用,可能通过调节或重建HPOA的功能来改善肾虚肝郁证DOR患者的临床症状与卵巢储备功能,促进月经来潮与受孕;②调节卵巢局部自分泌、旁分泌细胞因子如TGF-β超家族的相关成员AMH、BMP-15、TGF-β1,改善卵巢局部微环境,恢复卵巢功能。第三部分加减益经汤对CTX所致DOR SD雌鼠的卵巢功能及TGF-β超家族相关成员的研究目的:1、通过采用75mg/kg环磷酰胺(CTX)单次腹腔注射制造DOR SD雌鼠模型,证实模型的成功性与可逆性。2、通过对比西药补佳乐,研究加减益经汤高、中、低剂量对CTX所致的DOR SD雌鼠的卵巢功能的改善作用,以及对TGF-β超家族相关成员的作用,阐述加减益经汤的疗效及其可能的作用机理,为加减益经汤的临床推广应用提供实验证据。方法:采用前瞻性随机对照的研究方法,360只SPF级成年雌性SD大鼠造模后,按体重均衡原则随机分为空白对照组、模型对照组、补佳乐组、加减益经汤高、中、低剂量组(治疗组和模型组采用CTX 75mg/kg单次腹腔注射造模,空白对照组采用同等体积的生理盐水造模),分别灌胃等体积生理盐水、等体积生理盐水、0.09mg/kg补佳乐、0.9g/kg调经促孕丸、23.58g/kg加减益经汤、11.79g/kg加减益经汤、5.895g/kg加减益经汤,连续给药4周。于用药后的第1、2、3、4、6、8周,断颈处死处于动情间期的大鼠10只。观察各周大鼠一般情况,阴道脱落细胞,血清FSH、LH、E2、AMH、 INHB水平,卵巢指数,卵巢病理结构,各级卵泡数目、卵巢组织中AMH、TGF-β1、 TGF-β1R、 BMP-15的表达。结果:(1)造模后大鼠的一般情况:造模后大鼠的被毛疏松,活动减少,精神不振,四肢无力,给药4w后大鼠的外观体征、行为活动、精神状态、摄食、饮水、被毛、呼吸、口、眼、鼻、耳、大小便形状颜色等恢复正常,与空白对照组大鼠无差异。(2)对动情周期的影响:造模后大鼠规则的动情周期变化消失,由4~5d延长至7~16d,动情间期由1.5~2.5d延长至5~7d。模型组大鼠动情周期在造模后第6w恢复正常;补佳乐组、加减益经汤高、中剂量组大鼠动情周期在造模后第4w恢复正常;加减益经汤低剂量组大鼠动情周期在造模后第6w恢复正常。(3)对卵巢病理结构的影响:造模后大鼠卵巢髓质萎缩,皮质增生,纤维化样变,血管壁增厚,颗粒细胞层数减少,排列疏松,甚至空泡,卵巢中原始卵泡、成熟卵泡数减少,初级卵泡、次级卵泡和闭锁卵泡增加。造模后第2w对卵巢的病理结构损害达到最强。模型组第8w基本恢复正常;加减益经汤高、中剂量组和补佳乐组第4w基本恢复正常;加减益经汤低剂量组第6w基本恢复正常。(4)对卵巢指数的影响:模型组大鼠卵巢指数在造模后第1w、2w、3w、4w、6w较空白组明显降低(P<0.01),第8w无差异(P>0.05);模型组各w之间比较有差异(P<0.01),造模后第3w、4w、6w较造模后第1w明显降低(P<0.05或P<0.01)。与模型组与空白组比较,加减益经汤高、中剂量组大鼠卵巢指数在造模后第3w开始显著升高,恢复正常,持续至第8w(P<0.01)。补佳乐组、加减益经汤低剂量组大鼠卵巢指数在造模后第4w开始明显升高,持续至第8w,第8w恢复正常(P<0.05或P<0.01)。加减益经汤高、中剂量组大鼠卵巢指数在造模后第4w、6w、8w明显高于补佳乐组(P<0.05或P<0.01)。加减益经汤高剂量组卵巢指数在第4w明显高于低剂量组(P<0.05);中剂量组卵巢指数在第8w明显高于低剂量组(P<0.01)。(5)对各级卵泡数目的影响:模型组大鼠原始卵泡数、成熟卵泡数在造模后第1w、2w、3w、4w、6w、8w较空白组明显减少(P<0.01);模型组原始卵泡数各w之间比较有差异(P<0.05),第8w较第1w明显增加(P<0.05)。与模型组与空白组比较,加减益经汤高、中剂量组大鼠原始卵泡数、成熟卵泡数在造模后第2w开始明显增加,持续增加至第8w(P<0.05或P<0.01),原始卵泡数从第4w开始恢复正常(P>0.05),高剂量组成熟卵泡数在第6w恢复正常,中剂量组成熟卵泡数在第8w恢复正常(P>0.05);补佳乐组、加减益经汤低剂量组大鼠原始卵泡数、成熟卵泡数在造模后第3w开始明显增加,原始卵泡数持续增加至第8w(P<0.05或P<0.01),第4w恢复正常(P>0.05),成熟卵泡数持续增加至第6w(P<0.05或P<0.01)。加减益经汤高剂量组大鼠原始卵泡数在造模后第3w、8w明显高于补佳乐组、加减益经汤低剂量组(P<0.05或P<0.01);加减益经汤中剂量组大鼠原始卵泡数在造模后第3w明显高于补佳乐组、加减益经汤低剂量组(P<0.01)。加减益经汤高剂量组大鼠成熟卵泡数在造模后第6w明显多于补佳乐组(P<0.05),第4w、6w、8w明显多于加减益经汤低剂量组(P<0.05或P<0.01)模型组大鼠初级卵泡数、次级卵泡数、闭锁卵泡数在造模后第1w、2w、3w、4w、 6w、8w较空白组明显增加(P<0.01);模型组初级卵泡数、次级卵泡数、闭锁卵泡数各w之间比较有显著差异(P<0.01);对比第1w,初级卵泡数从第3w开始明显减少,次级卵泡数、闭锁卵泡数从第4w开始明显减少,持续至第8w(P<0.05或P<0.01)。与模型组与空白组比较,加减益经汤高、中剂量组大鼠初级卵泡数、次级卵泡数、闭锁卵泡数在造模后第2w开始明显减少,持续减少至第8w(P<0.05或P<0.01);高剂量组初级卵泡数从第4w开始恢复正常,中剂量组初级卵泡数第8w恢复正常(P>0.05);高、中剂量组次级卵泡数第8w恢复正常(P>0.05),闭锁卵泡数第3w恢复正常(P>0.05);补佳乐组、加减益经汤低剂量组大鼠初级卵泡数在造模后第3w开始明显减少,持续减少至第8w(P<0.05或P<0.01),第6w起恢复正常(P>0.05)。加减益经汤高、中剂量组大鼠初级卵泡数在造模后第3w、6w、8w明显少于补佳乐组、加减益经汤低剂量组(P<0.01);补佳乐组大鼠初级卵泡数在造模后第4w明显少于加减益经汤低剂量组(P<0.01)。加减益经汤高、中剂量组大鼠次级卵泡数在造模后第8w明显少于补佳乐组、加减益经汤低剂量组(P<0.05或P<0.01)。(6)对血清性激素FSH、LH、E2的影响:模型组大鼠FSH在造模后第1w、2w、3w、4w、6w、8w较空白组明显升高(P<0.01);模型组大鼠FSH各w之间比较有显著差异(P<0.01),从第4w开始明显降低,持续至第8w(P<0.05或P<0.01)。与模型对照组与空白对照组比较,加减益经汤高、中剂量组大鼠FSH在造模后第1w开始明显降低,一直持续降低至第8w(P<0.05或P<0.01),第4w恢复正常(P>0.05);补佳乐组、加减益经汤低剂量组大鼠FSH在造模后第2w开始明显降低,一直持续降低至第4w(P<0.05或P<0.01),补佳乐组第4w恢复正常,加减益经汤低剂量组第6w恢复正常(P>0.05)。模型组大鼠LH在造模后第1w、2w、3w、4w、6w较空白组明显升高(P<0.01),第8w恢复正常(P>0.05);模型组LH各w之间比较有差异(P<0.05)。与模型组与空白组比较,各治疗组大鼠LH在造模后第2w开始明显降低,加减益经汤高、中剂量组持续降低至第8w(P<0.05或P<0.01),第2w恢复正常(P>0.05);补佳乐组持续降低至第6w(P<0.05或P<0.01),补佳乐组第2w恢复正常(P>0.05);加减益经汤低剂量组持续降低至第4w(P<0.05),第3w恢复正常(P>0.05)。补佳乐组与加减益经汤中剂量组大鼠LH在造模后第2w明显低于加减益经汤低剂量组(P<0.05)。模型组大鼠E2在造模后第1w、2w、3w、4w、6w、8w较空白组明显降低(P<0.01);模型组大鼠E2各w之间比较,明显有差异(P<0.01),对比第1w,从第4w开始明显升高,持续至第8w(P<0.05或P<0.01)。与模型组与空白组比较,加减益经汤高、中剂量组与补佳乐组大鼠E2在造模后第1w开始明显升高,持续升高至第8w(P<0.05或P<0.01),第4w恢复正常(P>0.05);加减益经汤低剂量组大鼠E2在造模后第4w明显升高,持续升高至第6w(P<0.05或P<0.01)。补佳乐组大鼠E2在造模后第1w明显高于其他治疗组(P<0.05或P<0.01)。(7)对血清AMH、INHB的影响:模型组大鼠血清AMH、INHB在造模后第1w、2w、3w、4w、6w、8w较空白组明显降低(P<0.01);模型组大鼠血清ANH、INHB各w之间比较有显著差异(P<0.01),AMH从第3w开始明显升高,持续至第8w(P<0.05或P<0.01),INHB从第6w开始明显升高,持续至第8w(P<0.05或P<0.01)。与模型组和空白组比较,加减益经汤高、中剂量组与补佳乐组大鼠血清AMH在造模后第1w开始明显升高,持续升高至第8w(P<0.05或P<0.01),补佳乐组第4w恢复正常(P>0.05),加减益经汤高剂量组第8w恢复正常(P>0.05);加减益经汤低剂量组大鼠AMH在造模后第3w明显升高,持续升高至第8w(P<0.05)。补佳乐组、加减益经汤高、中剂量组大鼠AMH在造模后第2w明显高于加减益经汤低剂量组(P<0.05或P<0.01)。与模型组与空白组比较,加减益经汤高、中剂量组大鼠INHB在造模后第1w开始明显升高,持续升高至第8w(P<0.05或P<0.01),第8w恢复正常(P>0.05);补佳乐组与加减益经汤低剂量组大鼠INHB在造模后第4w明显升高(P<0.05)。(8)对卵巢组织中AMH、BMP-15、TGF-β1、TGF-β1R的影响:模型组大鼠卵巢组织中AMH、BMP-15、TGF-β1、TGF-β1R的IOD在造模后第1w、2w、3w、4w、6w、8w较空白组明显降低(P<0.01)。模型组大鼠卵巢组织中AMH/BMP-15、TGF-β1、TGF-β1R的IOD各w之间比较有显著差异(P<0.01)。对比第1w,AMH从第4w开始明显升高,持续升高至第8w(P<0.05或P<0.01);BMP-15第8w明显升高(P<0.05);TGF-β1第3w开始明显升高,持续升高至第8w(P<0.05或P<0.01);TGF-β1R第8w明显升高(P<0.05)。与模型组与空白组比较,加减益经汤高、中剂量组大鼠卵巢组织中AMH的IOD在造模后第1w开始明显升高,持续升高至第8w(P<0.05或P<0.01),加减益经汤高、中剂量组第6w恢复正常(P>0.05);补佳乐组与加减益经汤低剂量组大鼠卵巢组织中AMH的IOD在造模后第2w明显升高,补佳乐组持续升高至第8w(P<0.01),加减益经汤低剂量组持续升高至第4w(P<0.05或P<0.01)。加减益经汤高、中剂量组大鼠卵巢组织中AMH的IOD在造模后第2w高于加减益经汤低剂量组(P<0.05);加减益经汤中剂量组大鼠卵巢组织中AMH的IOD在造模后第3w高于补佳乐组(P<0.05)。与模型组与空白组比较,加减益经汤高剂量组与补佳乐组大鼠卵巢组织中BMP-15的IOD在造模后第1w开始明显升高,加减益经汤高剂量组持续升高至第6w,补佳乐组持续升高至第4w(P<0.05或P<0.01);加减益经汤中剂量组大鼠卵巢组织中BMP-15的IOD在造模后第2w开始明显升高,持续升高至第6w(P<0.01);加减益经汤低剂量组大鼠卵巢组织中BMP-15的IOD在造模后第4w开始明显升高,持续升高至第6w(P<0.01)。加减益经汤高剂量组大鼠卵巢组织中BMP-15的IOD在造模后第1w、2w、3w明显高于加减益经汤低剂量组(P<0.05或P<0.01);补佳乐组大鼠卵巢组织中BMP-15的IOD在造模后第1w、2w明显高于加减益经汤低剂量组(P<0.05或P<0.01);加减益经汤中剂量组大鼠卵巢组织中BMP-15的IOD在造模后第2w明显高于加减益经汤低剂量组(P<0.05)。与模型组与空白组比较,各治疗组大鼠卵巢组织中TGF-β 1的IOD在造模后第1w开始明显升高(P<0.05或P<0.01),加减益经汤高、中剂量组持续升高至第8w,补佳乐组、加减益经汤低剂量组持续升高至第4w(P<0.05或P<0.01);加减益经汤高剂量组大鼠卵巢组织中TGF-β1的IOD在造模后第8w恢复正常(P>0.05),明显高于补佳乐组、加减益经汤中、低剂量组(P<0.05或P<0.01)。与模型对照组与空白对照组比较,补佳乐组、加减益经汤高剂量组大鼠卵巢组织中TGF-β1R的IOD在造模后第1w开始明显升高(P<0.05或P<0.01),持续升高至第8w;加减益经汤中剂量组大鼠卵巢组织中TGF-β1R的IOD在造模后第2w开始明显升高(P<0.05或P<0.01),持续升高至第6w;加减益经汤低剂量组大鼠卵巢组织中TGF-βR的IOD在造模后第3w开始明显升高(P<0.05或P<0.01),持续升高至第6w。加减益经汤高剂量组大鼠卵巢组织中TGF-β1R的IOD在造模后第1w明显高于加减益经汤中剂量组(P<0.05)。结论:(1)采用75mg/kgCTX给SD雌鼠单次腹腔注射制造DOR大鼠模型是成功的。该法简便易行、成功率高、造模时间短、死亡率低,且模型的卵巢功能具有自我恢复能力,不同于POF模型。(2)加减益经汤、补佳乐均可明显改善DOR大鼠的卵巢储备功能,降低FSH. LH,升高E2与卵巢指数,增加原始卵泡、成熟卵泡数,减少初级卵泡、次级卵泡、闭锁卵泡数。在改善卵巢功能方面加减益经汤高、中剂量组较补佳乐组、加减益经汤低剂量组起效快,疗效好且持久。加减益经汤组的疗效呈现一定的剂量依赖关系。(3)加减益经汤、补佳乐改善DOR大鼠的卵巢储备功能的机制可能部分通过改善卵巢局部自分泌、旁分泌的TGF-β超家族的相关成员而实现。药物干预后,各治疗组可降低DOR大鼠血清AMH、INHB,增加卵巢组织中AMH、TGF-β1、TGF-β1R、 BMP-15的表达。在改善卵巢TGF-β超家族的相关成员方面,加减益经汤高、中剂量组较补佳乐组、加减益经汤低剂量组起效快,疗效好且持久。加减益经汤组的疗效呈现一定的剂量依赖关系。(4)加减益经汤能改善卵巢局部自分泌、旁分泌细胞因子如AMH、INHB、 TGF-β1、TGF-β1R、BMP-15,从而抑制卵泡募集,促进卵泡的发育、成熟,改善卵巢功能。它改善卵巢功能疗效好,且安全、无副作用,可研发成中成药,在临床推广应用。加减益经汤中剂量可能是最佳剂量。