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猪圆环病毒2型(PCV-2)是当前严重危害猪只健康的病毒性病原之一,在猪群中广泛存在,并常与其它猪病病原混合感染诱发各种综合征,与其相关的诸多疾病统称为猪圆环病毒相关疾病(PCVAD)。此类疾病症状复杂,难以治疗,应进行及时的感染检测和有效的预防为主的综合防制。目前为止,国外部分针对PCV-2的疫苗已在临床试验中取得成功,有的已于近期在国内投入应用。其它候选疫苗尚处在积极研究过程中,研究新型保护力确实的PCV-2疫苗,提高疫苗的免疫效果,对于PCVAD的防制有重要意义为了确定PCV-2核衣壳蛋白上的优势线性B细胞表位以及核定位信号肽(NLS)上是否存在功能性抗原表位,本研究根据已发表的有关Cap蛋白上B细胞表位的分布情况和生物信息学软件预测结果,设计3对特异性引物,分段扩增含NLS的片段F2-1及去NLS的片段F2-2和XF2-2,所得片段亚克隆到pET-32a(+)载体中,分别构建融合表达载体pET-F2-1、pET-F2-2和pET-XF2-2。表达载体分别转化大肠杆菌Rosetta(DE3),IPTG诱导表达成功,得到截短表达蛋白His-F2-1、His-F2-2和His-XF2-2,大小分别为35.9 kDa、33.6 kDa和38.6 kDa。用PCV-2阳性血清进行的ELISA检测结果表明,蛋白His-XF2-2与PCV-2阳性血清的免疫反应最强。表达的融合蛋白纯化后免疫BALB/c小鼠制备单克隆抗体(mAb),试验筛选出七株针对Cap蛋白的mAbs,借助ELISA叠加试验和抗原抗体交叉反应试验确定单抗FmAb-2、FmAb-3、FmAb-8和FmAb-10结合在Cap蛋白的97-141 aa;FmAb-7和FmAb-13结合在Cap蛋白的55-96 aa;FmAb-15结合在Cap蛋白的142-211 aa。对His-XF2-2和七株mAbs免疫反应性进行了检测和比较,结果显示结合于Cap蛋白的97-141 aa位的单抗FmAb-8与His-XF2-2有最强的反应性。根据单抗结合区域97-141 aa的氨基酸序列,合成包含15个氨基酸的多肽,相邻多肽有5个氨基酸重复,借助dot-ELISA,peptide ELISA方法和多肽扫描技术(PEPSACN),确定122-136 aa(A V I L N D N F V T K A T A L)为优势线性B细胞表位。以His-XF2-2和单抗FmAb-8分别建立间接ELISA和双夹心ELISA方法进行PCV-2的抗体和抗原检测,均取得良好的检测效果。通过PCR方法分别从含有PCV-2的Cap基因和猪γ-干扰素(PoIFN-γ)基因的重组克隆载体pMD18-PCV-2Cap和pMD18-PoIFN-γ中扩增出Cap和PoIFN-γ基因,将两基因亚克隆到哺乳动物细胞表达载体pBudCE4.1中,构建重组双表达载体pBud-IFN-PCV。与原核表达体系截短表达的Cap蛋白一起,采用Prime-Boost策略免疫模型动物BALB/c小鼠。采用免疫信息学方法,借助在线T细胞表位预测方法预测Cap蛋白中可能的九肽细胞毒性T淋巴细胞(CTL)表位并进行多肽合成。分离免疫小鼠的脾淋巴细胞,与合成的多肽体外共刺激培养后,选用酶联免疫斑点技术(ELISPOT)和胞内细胞因子染色技术(ICS)筛选鉴定CTL表位。实验结果表明,经短肽R116 G V G S S A V I、T137 Y D P Y V N Y S和R159 Y F T P K P V L以及PMA+Ionomycin阳性组合共刺激的小鼠脾淋巴细胞孔均能检测到分泌IFN-γ的阳性细胞。统计分析结果显示,小鼠脾淋巴细胞经短肽R116 G V G S S A V I、T137 Y D P Y V N Y S和R159 Y F T P K P V L刺激后，分泌IFN-γ的CD8+ T淋巴细胞数量与经其它短肽刺激后的CD8+ T淋巴细胞数量相比较差异极显著（P<0.01）。本研究成功在原核表达系统内分段表达了包括NLS序列的PCV-2 Cap基因，表达的融合蛋白免疫小鼠后筛选出七株针对Cap蛋白的单克隆抗体，并通过PEPSCAN技术确定出一个优势线性B细胞表位。研究中以小鼠为实验动物模型鉴定出PCV-2 Cap蛋白上的三个CTL表位，其中T137 Y D P Y V N Y S和R159 Y F T P K P V L两个CTL表位为H-2Kd限制性表位，R116 G V G S S AV I为H-2Dd限制性。优势线性B细胞表位的鉴定及其相应单抗的制备为疑似PCV-2感染病例更为准确的抗体和抗原检测奠定了良好的基础；Cap蛋白上CTL表位的鉴定将为PCV-2细胞免疫机制及新型表位肽疫苗的研究奠定基础。