1研究背景与目的食管癌是世界上最常见的六大恶性肿瘤之一。河南、河北和山西三省交界的太行山地区是中国,也是世界上食管癌发病率和死亡率最高的地区之一。在世界上食管癌具有显著的地域性分布差异,尤其在中国的高发区更普遍,提示环境因素可能在食管癌的发生中起重要作用。吸烟饮酒等环境因素在西方国家已经证明与90%以上食管鳞癌的发生有关,然而在亚洲或中国不同的研究组发现吸烟饮酒与食管鳞癌患病风险的关系很不一致。因此,本研究通过大样本量的流调探讨吸烟饮酒与中国高发区食管癌的风险关系。环境因素引起DNA损伤主要的分子改变：DNA甲基化。强的环境因素能引起甲基化,当环境因素消失或者其它因素的影响,甲基化又可恢复正常,基因的突变、移位或缺失也可引起某些特定部位的甲基化。大量文献报道,抑癌基因的甲基化异常往往为食管癌发生的早期分子事件,可能作为食管癌早期诊断的分子标志物。而且甲基化DNA在外周血中较稳定,因此外周血中甲基化异常的检测具有肿瘤早期诊断的重要价值。大量研究报道,在不同人群的食管癌组织中采用最常见的技术仅检测一个基因或数个基因甲基化的频率。这些技术检测位点有限,很难找到关键的甲基化基因,因此,特异性标志物将来真正用于临床,必须运用高通量的检测技术,搜寻食管癌候选甲基化位点。然而,传统的恶性肿瘤标志物的搜寻和鉴定多数是对一定数量的肿瘤患者和正常人进行对比,确定肿瘤标志物。这些人群多为散在的个体,从遗传发育角度讲,在肿瘤发生前,他们之间就有许多差异,这些差异可能大多数纯属个体差异,与肿瘤发生无关；成年后,这些人群不同程度发生肿瘤,期间出现了新的肿瘤相关基因改变,但当此时与正常人比较研究时,这种肿瘤相关的差异基因(极少数)就与遗传发育上的个体差异基因混为一体,给筛查和识别真正的肿瘤甲基化标志物带来极大困扰。如何降低或缩小这种背景差异,是筛查特异性食管癌标志物最具挑战性的问题。本研究一反以往从不同个体搜寻肿瘤标志物的思路,利用独特的同卵双胞胎食管癌患者作为研究对象,对比分析双胞胎成员中一人患病,另一人正常的分子差异,确定肿瘤相关甲基化基因。由于同卵双胞胎理论上出生时遗传背景完全相同,这就最大程度减小了个体差异所造成的“噪音”基因,为我们获得食管癌特异性肿瘤标志物提供了独特的途径。我们通过高通量技术来检测同卵双胞胎中食管癌发生的关键甲基化位点,寻找与食管癌发生的候选甲基化基因,为进一步阐明甲基化在食管癌发生中的作用提供理论依据,更为加深对食管癌变分子机制的了解,并为食管癌早期诊断和高危人群预警提供候选指标。2材料与方法2.1研究对象7548例食管癌患者来自河南、河北和山西三省交界的安阳肿瘤医院、林州肿瘤医院、长治医学院附属和平医院和磁县人民医院等食管癌高发区,主要是2006年以后确诊的食管癌病人并均经病理证实为食管鳞状细胞癌；13014例正常对照来自上述医院的门诊和人群普查对象,主要是2009年以后均经内镜检查排除食管和胃肿瘤的正常人。2对男性同卵双胞胎来自河南食管癌高发区,均为单发食管癌患者。2对双胞胎均抽取3ml抗凝血及食管粘膜病变均经活检组织病理检查确诊。2.2问卷调查和家访分别从上述地区收集食管癌病人和正常对照及双胞胎的资料入户进行家访和问卷调查,内容包括：个人基本情况、文化水平、烟酒史、肿瘤家族史、生活习惯和家庭收入等。并进一步从患者就诊医院获得详细临床病理资料。2.3卵型鉴定根据相似度、ABO血型和短串联重复序列进行鉴定。2.4人类甲基化芯片杂交我们利用含有27,578个CpG位点Illumina Infinium Human Methylation27 Bead Chip检测2对同卵双胞胎单发食管鳞状细胞癌DNA的甲基化改变。采用Qiagen试剂盒抽提全血DNA,质检后,将DNA中未甲基化CPG岛的C转化为T；经过DNA扩增、酶切、沉淀和悬浮,芯片杂交、洗涤、染色和保护、扫描等步骤。2.5统计处理2.5.1大流调资料数据分析将所有收集到的临床资料录入Excel表,运用SPSS17.0统计软件,进行χ2检验,检验水准α=0.05及多因素logistic回归分析(P进入=0.05,P删除=0.10)。2.5.2甲基化数据分析运用Bead Studio’s Methylation Module v3.2软件进行数据分析,并根据P<0.004及Delta Beta的绝对值≥0.17进行了差异甲基化位点的筛选。3结果3.1环境因素与食管癌患病的风险关系调整性别年龄后,吸烟人群与不吸烟人群相比患食管癌风险增加1.17倍;而饮酒与食管癌患病风险无关联。3.2 DNA甲基化与同卵双胞胎食管癌的关系通过对同卵双胞胎食管癌与正常DNA差异甲基化位点的比较,我们发现2对双胞胎共用的10个有差异的甲基化位点,其对应的甲基化差异基因分别是KCNE1、TP53I3、NFE2、TNFSF13B、AIM2、CTAGE5、ZNF185、ARID3A、OR10J1和HIPK3。4结论4.1大样本量食管癌患者流调发现吸烟是中国食管癌高发区人群患病风险因素。4.2同卵双胞单发食管癌DNA甲基化位点分析发现10个在癌与正常全血DNA中存在明显差异甲基化基因,可能是高危人群筛查的一部分候选分子标志物。