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目的:食管癌(esophageal carcinoma, EC)是世界上最常见的消化道恶性肿瘤之一,我国是EC高发区,发病率仅次于胃癌而居消化道肿瘤发病率第二位,严重威胁着人们的生命健康。因此,探讨EC的发病机制,寻找新的治疗靶点及有效的治疗药物,对降低EC的死亡率,延长患者的寿命,将有十分重要的意义。目前普遍认为细胞周期调控异常是肿瘤发生、发展的重要机制之一。细胞分裂周期25(cell division cycle 25, CDC25)双特异磷酸酯酶作为细胞周期正向调节因子,其与肿瘤的关系倍受关注。目前已发现人类共有三种CDC25同型异构体——CDC25A、CDC25B和CDC25C,其中CDC25A可通过去除位于细胞周期蛋白依赖性激酶(cyclin-dependent kinases, CDK) ATP结合位点上苏氨酸、酪氨酸残基抑制性磷酸化而活化CDK,使其与相应的细胞周期蛋白(cyclin)结合,这一过程是细胞由G1期进入S期及由G2期进入M期所必需的。已有研究证实,CDC25A在多种肿瘤组织中均有过度表达,这为解释肿瘤细胞周期紊乱、生长旺盛、过度增殖提供了证据。因此,CDC25A可能是一些调控细胞周期的抗肿瘤药物的新靶点。青蒿琥酯(artesunate, ART)是半合成的青蒿素(artemisinin)的衍生物。最近研究表明,ART除了具有经典抗疟活性以外,还可通过调控细胞周期对人体多种肿瘤细胞发挥抑瘤作用,但ART是否可通过调控细胞周期而对人食管癌发挥抑瘤作用,其调控细胞周期是否与CDC25A有关尚不十分清楚。人体内CDC25A的表达水平主要通过泛素依赖的蛋白酶体降解途径加以调控。以往的证据显示,转化生长因子-β(transforming growth factor-β, TGF-β)介导的信号转导可促进靶蛋白的泛素化,进而加速靶蛋白的降解。而Smad3则是这一过程的限速因子。但TGF-β/Smad3信号转导通路是否参与CDC25A的表达调控尚不清楚。最新的研究显示,多种肿瘤细胞系高表达CDC25A是由于泛素依赖的蛋白酶体降解途径的功能异常,同时伴有TGF-β/Smad3信号转导蛋白表达异常,提示TGF-β/Smad3信号转导通路有可能通过调节泛素依赖的蛋白酶体降解途径而影响CDC25A的表达水平。ART是否可通过TGF-β/Smad3信号转导通路调节CDC25A的表达,进而调节细胞周期进程尚不清楚。为此,本研究拟探讨CDC25A及TGF-β/Smad3信号转导蛋白在食管上皮癌变过程中的表达情况及其与临床病理特征的关系;分析ART对人食管癌Eca-109细胞增殖、细胞周期以及CDC25A、TGF-β和Smad3表达的影响及其对健康成年人外周血单个核细胞(human peripheral blood mononuclear cell, hPBMC)增殖活性的影响,并进一步应用RNA干扰(RNA interference, RNAi)技术沉默Smad3,探讨TGF-β/Smad3信号转导通路与CDC25A表达及ART周期阻滞作用之间的关系,以期揭示ART诱导细胞周期阻滞的细胞内信号转导机制。此外,本研究还将探讨ART对裸鼠食管癌移植瘤模型的增殖、细胞周期以及CDC25A和Smad3表达的影响,为将ART应用于人食管癌治疗提供新的理论和实验依据。方法1食管上皮癌变过程中CDC25A、TGF-β和Smad3蛋白的表达及其与临床病理特征的关系收集食管癌手术切除标本52例,每例标本分别取癌组织、癌旁组织(距癌边缘2cm)及手术切缘正常食管粘膜(距癌边缘5cm以上),经病理组织学诊断证实,其中正常食管粘膜上皮24例,非典型增生组织25例(轻度非典型增生23例,中重度非典型增生2例),浸润性食管鳞状细胞癌(squamous cell carcinoma, SCC)组织52例(高分化SCC 21例,中低分化SCC 31例)。采用免疫组织化学法(immunohistochemistry, IHC)检测CDC25A、TGF-β及Smad3的表达情况,采用逆转录聚合酶链反应(reverse transcription-polymerase chain reaction, RT-PCR)方法检测40例术中收集的新鲜食管癌、同个体癌旁食管粘膜和手术切缘正常食管粘膜组织中CDC25A的mRNA表达,分析CDC25A、TGF-β和Smad3的表达与临床病理特征的关系。2 ART对人食管癌Eca-109细胞和hPBMC的细胞增殖和细胞周期的影响及机制常规培养人食管癌Eca-109细胞。以不同浓度的ART(1、10、100μmol/L)分别作用于Eca-109细胞24、48、72h,采用MTT法观察ART对Eca-109细胞生长的影响;常规分离培养hPBMC,同时加入ConA(10μg/ml)以及不同浓度ART(1、10、100μmol/L),培养24、48、72h,采用MTT法观察ART对hPBMC增殖的影响;流式细胞术(flow cytometry, FCM)检测细胞周期分布;半定量RT-PCR方法检测CDC25A、TGF-β及Smad3 mRNA表达的变化;Western blot检测CDC25A、TGF-β及Smad3蛋白表达的变化。进一步以RNAi沉默Eca-109细胞的Smad3,由武汉晶赛公司根据人Smad3基因序列转录RNA的位置及小干扰RNA(small interference RNA, siRNA)设计原则,设计了2个靶位点,并据此构建了2个针对靶位点的载体编码小发夹状RNA(small hairpin RNA, shRNA)的质粒表达载体(S1和S2),同时合成了一个阴性对照质粒表达载体(HK)。这些载体能表达绿色荧光蛋白(green fluorescence protein,GFP)和具有新霉素(neomycin, neo)抗性。采用阳离子脂质体将它们转染入人食管癌Eca-109细胞;FCM观察转染效率,选择出阳离子脂质体和质粒表达载体最合适的比例;在转染48h后,分别采用RT-PCR和Western blot方法观察Eca-109细胞Smad3 mRNA和蛋白沉默效果,筛选出干扰效果最好的质粒表达载体,用于后续实验。将干扰效果最好的质粒表达载体转染入细胞后加入ART继续培养24、48、72h,采用MTT法检测细胞增殖;采用RT-PCR和FCM方法检测CDC25A mRNA和蛋白表达随时间变化规律;采用FCM检测细胞周期分布,分析TGF-β/Smad3信号转导通路在ART诱导人食管癌细胞周期阻滞中的作用。3 ART对人食管癌裸鼠移植瘤生长的影响及其机制研究将人食管癌Eca-109细胞接种于30只BALB/c nu/nu裸鼠(4周龄,雌雄各半,18~20g)左前肢皮下(6×106/200μl/只),构建食管癌裸鼠移植瘤模型。30只裸鼠随机分为实验组和对照组(每组6只)。接种后第7天,实验组分别给予100、200、300 mg/kg ART,腹腔注射,连用7d,停药一周,再继续连用7d;阳性对照组给予3mg/kg顺铂(DDP),腹腔注射,连用7d;阴性对照组给予生理盐水代替ART。实验过程中每隔3d测量一次裸鼠的体重及肿瘤的长、短径,计算肿瘤体积=长径×短径2/2,绘制肿瘤生长曲线。ART停药一天后采用拉颈法统一无痛苦处死裸鼠,取瘤块称重。FCM检测移植瘤细胞周期变化,RT-PCR、IHC法检测CDC25A mRNA和蛋白表达,FCM法检测Smad3蛋白表达变化。结果1食管上皮癌变过程中CDC25A、TGF-β和Smad3的表达及其与临床病理特征的关系①食管正常粘膜组织、非典型增生组织和浸润性SCC中CDC25A mRNA和蛋白表达是一致的。浸润性SCC中CDC25A mRNA和蛋白阳性表达率(53.8%和50.0%)明显高于非典型增生组织(20.0%和16.0%)和正常组织(4.2%和0%)(P均<0.01),非典型增生组织与手术切缘正常组织之间差异无显著性(P均>0.05)。CDC25A蛋白阳性表达率,中低分化、侵袭至纤维膜、有淋巴结转移者明显高于高分化、未侵袭至纤维膜和无淋巴结转移者(P均<0.05)。②浸润性SCC中TGF-β蛋白阳性表达率(67.3%)明显高于非典型增生组织(36.0%)和正常组织(33.3%)(P均<0.01),非典型增生组织与手术切缘正常组织之间差异无显著性(P均>0.05)。TGF-β蛋白阳性表达率,有淋巴结转移者显著高于无淋巴结转移者(P <0.05)。③浸润性SCC中Smad3蛋白阳性表达率(28.8%)明显低于非典型增生组织(56.0%)和正常组织(58.3%)(P均<0.01),非典型增生组织与手术切缘正常组织之间差异无显著性(P均>0.05)。Smad3蛋白阳性表达率与各临床病理特征间无显著相关性。④CDC25A蛋白表达与Smad3蛋白表达呈负相关(rs=-0.473,P=0.000),TGF-β蛋白表达与CDC25A及Smad3蛋白表达均无显著相关性(rs =0.117,P=0.182; rs=0.133,P=0.121)。2 ART对人食管癌Eca-109细胞和hPBMC增殖及细胞周期的影响及机制①1、10、100μmol/L ART均能显著抑制Eca-109细胞的增殖,且呈时间、剂量依赖关系,最大抑制率可达(78.31±1.48)%,其IC50值为(68.80±0.76)μmol/L。②各实验浓度ART对ConA刺激下hPBMC的增殖仅有轻微的抑制作用,抑制率约为2%~8%。③1、10μmol/L ART可使S期细胞明显减少,大部分细胞的生长被阻滞在G0/G1期。而100μmol/L ART亦可使S期细胞数目减少,但其作用主要表现为将细胞阻滞在G2/M期。④实验浓度的ART作用24、48、72h后,CDC25A mRNA及蛋白的表达较对照组降低(P<0.05), Smad3 mRNA及蛋白的表达较对照组升高(P<0.05),TGF-β的表达无显著变化(P>0.05)。⑤当阳离子脂质体/质粒表达载体=6μl/1.0μg转染人食管癌Eca-109细胞时,转染效率达到72.6%。转染48h后,S2对人食管癌Eca-109细胞Smad3沉默的效果最好。⑥Eca-109细胞转染S2后24h,Smad3 mRNA和蛋白的表达开始下降,至48h时检测不到,72 h时Smad3 mRNA和蛋白微量表达。⑦将S2转染入细胞后加入ART,继续培养24、48、72h,MTT结果显示Eca-109细胞的增殖没有显著变化。⑧FCM检测结果显示,转染S2后加入ART 24、48、72h,Eca-109细胞的细胞周期分布与对照组比较无显著差异。⑨RT-PCR及FCM检测结果显示,转染S2后加入ART 24、48、72h, Eca-109细胞CDC25A表达水平与对照组比较无显著差异。3 ART对人食管癌裸鼠移植瘤生长的影响及其机制①成功构建人食管癌裸鼠移植瘤模型,成瘤率达100%。②实验结束时,各实验组肿瘤的体积及重量均明显小于对照组(P<0.01),各ART组体积抑瘤率分别为32.6%、76.4%、18.0%,重量抑瘤率分别为11.4%、63.2%、21.6%,DDP组体积抑瘤率为78.3%,重量抑瘤率为64.7%。③与对照组相比,ART实验组移植瘤G0/G1期细胞比例升高,S期比例降低;CDC25A mRNA及蛋白表达水平降低,Smad3蛋白水平升高。结论1在食管上皮的癌变过程中, SCC的CDC25A蛋白的表达显著高于正常上皮及非典型增生组织,而后二者CDC25A蛋白的表达无显著性差异。CDC25A过表达参与SCC的发生和转移,提示CDC25A在食管癌发生发展中具有重要作用,选择性抑制CDC25A表达可能成为防治食管癌的有效途径之一。2首次对食管癌上皮癌变过程中TGF-β信号转导通路的重要成员Smad3表达水平进行分析。Smad3蛋白表达水平在浸润性SCC组显著低于非典型增生组织和正常组织,而后二者Smad3蛋白的表达无显著性差异。Smad3与CDC25A的表达呈负相关,提示两者的异常表达共同参与了食管癌的发生、发展过程,增加Smad3的表达有可能是抑制CDC25A表达的有效方法。3 ART能在体外抑制食管癌Eca-109细胞增殖,但对hPBMC增殖影响较小,提示其对人体免疫功能影响较小。其抑瘤机制可能与诱导Eca-109细胞G0/G1期及G2/M期阻滞有关。4本实验首次证实ART能在体内抑制人食管癌裸鼠皮下移植瘤的生长,且无明显的毒副作用,为将ART应用于食管癌的治疗提供了实验依据。5 ART可在体内外下调食管癌Eca-109细胞CDC25A的表达,同时上调Smad3的表达。ART的抗食管癌作用可能通过下调CDC25A表达而实现,TGF-β/Smad3信号转导通路有可能是ART下调CDC25A表达的主要途径。应用RNAi沉默Smad3可在体外抑制由ART诱导的CDC25A的下调,提示Smad3是这一过程的关键因子,目前国内外尚未见相关报道。