论文部分内容阅读
背景和目的自发性蛛网膜下腔出血(subarachnoidhemorrhage,SAH)是一类最常见的危重脑血管疾病,具有高致残率和高致死率的特点。随着诊治技术和材料的进步,一定程度上控制了高颅压、低灌注、再出血等情况的发生,但是很多SAH患者的治疗效果不理想,临床预后未见明显改善。研究证实SAH后的早期脑损伤(early brain injury,EBI)是导致此类患者预后不佳的重要原因,同时SAH后的炎症反应是导致EBI的重要病理生理机制之一。越来越多的研究指出炎症小体(inflammasome)参与SAH后的EBI过程。炎症小体是一类由多种蛋白质组成的胞质内复合体,是机体自身免疫系统的重要组成部分。焦亡(pyroptosis)是近年来新发现的一类由炎症小体促发的炎性程序性细胞死亡方式。焦亡启动后不仅使细胞快速死亡,还通过释放促炎介质进一步加重炎症反应。黑色素瘤缺乏因子2(absent in melanoma 2,AIM2)炎症小体是一类主要表达于神经元的炎症小体,也是目前唯一已知的可识别异位双链DNA的炎症小体。活化的AIM2炎症小体可以诱导神经元发生焦亡。因此,本课题拟探究AIM2炎症小体介导的细胞焦亡在SAH后EBI中的作用。方法:第一部分:我们收集行髋关节成形术患者和SAH患者出血72 h内的脑脊液(cerebrospinal fluid,CSF),通过蛋白质印记法(Western Blot)检测所有 CSF标本中AIM2蛋白的表达水平,观察并分析AIM2蛋白表达水平与SAH患者病情严重程度的相关性。第二部分:分别建立SAH体内和体外模型,通过Western Blot、免疫组化、Nissl染色、免疫荧光、流式细胞术、扫描电子显微镜等检测AIM2炎症小体在SAH后的激活情况,并探索AIM2炎症小体介导的细胞焦亡,即AIM2/caspase-1/GSDMD通路,在SAH后EBI中的作用。第三部分:采用慢病毒敲减AIM2、caspase-1干扰AIM2炎症小体的激活,运用Western Blot、免疫化学染色、流式细胞术等技术检测体内、体外AIM2/caspase-1/GSDMD 通路在 SAH 后 EBI 中的变化。结果:第一部分:Western Blot检测显示SAH患者CSF中的AIM2蛋白表达水平显著高于髋关节成形术患者;SAH患者病情越严重(Hunt-Hess分级越高),AIM2蛋白的表达水平越高。第二部分:在体内小鼠SAH模型中,Nissl染色显示SAH后24 h小鼠颞叶皮层可见大量胞体皱缩、胞浆深染、胞核固缩的异常神经细胞;与SAH24 h相比,SAH 72 h后颞叶皮层神经细胞虽然也大量损伤,但这种情况有所好转,仍可见部分神经细胞存活。免疫组化染色显示SAH后24 h小鼠颞叶皮层可见大量AIM2、GSDMD、caspase-1、ASC 免疫阳性细胞。Western Blot 结果显示 AIM2炎症小体介导的细胞焦亡,即AIM2/Caspase-1/GSDMD通路在SAH后12 h显著激活,并在24 h达高峰,在72 h有所下降。在体外神经元SAH模型中,扫描电子显微镜提示氧化血红蛋白(oxyhemoglobin,OxyHb)刺激后神经元呈焦亡样改变;免疫荧光染色显示OxyHb刺激后神经元中AIM2、GSDMD、caspase-1、ASC蛋白的免疫荧光增强,且AIM2蛋白在胞质、胞核中表达,GSDMD、caspase-1、ASC蛋白则在胞质中表达;Western Blot结果显示AIM2/caspase-1/GSDMD通路在OxyHb后6 h明显激活并持续活化;流式细胞术提示AIM2炎症小体介导的神经元焦亡在OxyHb后6 h显著增加。第三部分:通过慢病毒敲减AIM2和caspase-1抑制AIM2炎症小体的激活后,体内、体外SAH模型均显示AIM2介导的细胞焦亡明显减少,改善了 SAH后的脑损伤。同时,敲减caspase-1后抑制了 caspase-3的激活,从而减轻了 SAH后的神经元凋亡。结论:本研究证实了 AIM2炎症小体介导的细胞焦亡,即AIM2/caspase-1/GSDMD通路参与SAH后的EBI过程。通过敲减AIM2和caspase-1抑制AIM2炎症小体的激活可以减轻AIM2炎症小体介导的细胞焦亡;同时敲减caspase-1后还抑制了 caspase-3的激活,减轻了 SAH后的神经元凋亡。Caspase-1可能成为SAH后治疗EBI的重要靶点。