论文部分内容阅读
目的：糖尿病患者创伤后创面不易愈合为临床常见问题,其中又以2型糖尿病患者较为多见。本实验通过应用2型糖尿病大鼠模型，探讨外源性GM-CSF对2型糖尿病大鼠创面愈合的影响及其机制。方法：取2月龄SPF级雌性大鼠70只，体重（200±15）g，在高脂高糖饲料环境下喂养6周后开始造模，造模前禁食12小时，不禁水。STZ用新配制的0.1mmol/L柠檬酸缓冲液（PH=4.2）稀释，大鼠称重后腹腔一次性注射STZ35mg/kg，48小时后血糖平稳时进行血糖监测。选取造模成功的55只大鼠以10%水合氯醛（300mg/kg）腹腔麻醉后背部剃毛，在背部中线靠大腿两侧采用模具各制作直径1.5cm的圆形创面，创面面积约为1.77cm2。将皮肤沿画线处切开，深至深筋膜下。随机选取造模成功的40只大鼠分为2组：对照组为糖尿病（DM）创面20只，实验组为糖尿病创面+GM-CSF20只（创面注入GM-CSF0.5ug/kg）。另取15只大鼠分为5组，每组3只。A组：DM组；B组：DM+腹腔注射生理盐水组；C组：DM+腹腔注射GM-CSF；D组：DM+局部GM-CSF；E组：DM+局部生理盐水组，大鼠分笼饲养。肉眼观察各组大鼠术后第3、5、8、12、18天创面组织愈合情况,同时每天大鼠称重，在尾静脉抽血监测血糖值。记录每只大鼠的体重、血糖变化及身体状况变化情况。利用透明方格纸沿创面愈合外缘描绘得到第3、5、8、12、18天的创面面积，计算创面愈合率。沿愈合创面外缘超出约1cm切下创面组织，制片后光镜观察创面各类细胞、深层组织愈合情况。取样行透射电镜观察成纤维细胞形态，免疫组化实验观察PCNA，BCL-2阳性细胞。结果：在各时间点上，注射GM-CSF药物实验组愈合平均面积明显大于对照组。在愈合时间上，实验组平均为19.50±1.29天，对照组为22.00±0.82天。HE染色：实验组第3天创面内存在大量渗出物和大量中性粒细胞等炎性细胞，细胞种类、数量多；对照组细胞数量少，组织结构不清晰。实验组第5天组织结构较清晰，开始存在少量肉芽组织和腺样结构；对照组大量细胞浸润，细胞排列混乱。实验组第8-12天可见大量成纤维细胞，出现胶原束和皮肤结构，组织分层愈合良好，出现上皮层和结缔组织层，可见大量毛细血管和少量腺体生成；对照组第8-12天成纤维细胞数量较实验组少，存在少量炎性细胞，组织结构不清晰。18天时两组创面基本愈合，细胞种类减少，存在大量胶原束，毛细血管增多，基本恢复表皮结构；实验组表皮结构较为光滑。透射电镜观察：实验组15000倍下可见成纤维细胞体积较大，形态完好，周围胶原分泌丰富（图3）；40000倍下可见细胞内容物丰富，胞内大量内质网和核糖体，线粒体数量多、体积大，成纤维细胞无水肿、破裂情况（图4）。对照组15000倍下成纤维细胞胶原分泌少，细胞内有水肿（图5）；40000倍下可见粗面内质网数量明显减少，内质网显著扩张，细胞内容物少，出现水肿囊泡化，粗面内质网上的核糖体数量少，线粒体数量较实验组少，部分线粒体模糊不清（图6）。PCNA免疫组化结果：第3、5、8、12、18天时，实验组PCNA阳性表达平均值高于对照组，第3、5、8天阳性表达率显著高于后三个时间点。统计学检验证实第5、8天时实验组与对照组之间阳性表达率P<0.05，第3、12天时P<0.01，均具有统计学意义。BCL-2免疫组化结果：对照组第3、5、8、12天时阳性表达低于实验组。在创面愈合过程中BCL-2表达在第3-8天最为明显，第5天时达到峰值。实验组第5天时的BCL-2阳性表达，远高于对照组及其它各时间点。MMP-2的western blot检测可见A组MMP-2表达量最高；B组表达略低；C组MMP-2量较低；D组为局部创面给予GM-CSF，MMP-2表达极少；E组MMP-2表达略少，与C组表达量相仿。结论：外源性GM-CSF治疗后，2型糖尿病大鼠创面愈合速度加快，愈合情况良好。GM-CSF治疗具有多靶点作用，包括：通过作用于PCNA间接促进成纤维细胞增殖、加快伤口愈合；激活BCL-2抑制细胞凋亡、抵抗外源性损害；抑制MMP-2对细胞外透明膜的分解作用等。