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在最近的二十年中，作为一个筛分比率逐年增加的海产品腐败菌及鱼类致病菌，嗜麦芽单胞菌（Stenotrophomonas maltophilia）对水产养殖业具有潜在的危害性，其低温下较强的蛋白酶水解能力是导致海产品腐败和鱼类致病的重要因素。S.maltophilia低温诱导产生的蛋白酶种类和特性，还没有文献详细报道，而且温度诱导蛋白酶产生的调控机制也不清楚。本课题针对以上两个问题进行初步的研究与探索:一是对低温诱导产生的蛋白酶分离纯化，详细了解该酶的特性及一级结构特征;二是对温度响应蛋白酶的调控机制进行初步探索。 (1)通过富集培养的方法从冷冻的南极磷虾中分离得到一株低温下高产蛋白酶的菌株，通过16S rDNA和生理生化分析鉴定为嗜麦芽单胞菌，命名为S.maltophilia FF11。菌株在低温（15℃和25℃）下产生胞外蛋白酶活性高，而37℃下几乎检测不到蛋白酶活性。酶谱分析表明，S.maltophilia FF11主要的蛋白酶仅在低温下产生，在37℃并不产生，此蛋白酶命名为SmtP（S.maltophilia temperature-responsive protease）。通过硫酸铵沉淀、阴离子交换层析（Q-Sepharose Fast Flow chromatography）和凝胶筛分层析(Superdex75)，从S.maltophilia FF11发酵液中分离纯化出电泳纯的蛋白酶SmtP;该酶在高盐(4M)和有机溶剂(50％)环境下具有较高的活性及较强的耐受性。肽指纹图谱分析及基因克隆测序获得了编码该酶的全基因序列，基因全长为1854bp，编码617氨基酸蛋白酶的前体（GeneBank序列号为KP399635）。N端测序(LVPND)和质谱分子量(37.4kDa)，确定成熟酶由368个氨基酸组成，获得了该酶的一级结构序列。 (2)实时定量PCR和启动子融合分析表明，温度影响SmtP的产生至少发生在转录水平上。利用自杀载体pEX18Tc，采用双亲结合的方法，敲除S.maltophilia FF11一个cAMP受体类似蛋白(cAMP receptor protein-like，Clp)，获得Δclp菌株。clp的敲除显著减少了S.maltophilia FF11在15℃和25℃下的蛋白酶活性，酶谱结果显示，Δclp菌株不再产生SmtP。实时定量PCR和启动子活性分析表明，Clp能够正向调控smtP的表达。同时，clp的表达同样具有温度依赖性的特征。 (3)生物信息学分析显示，在S.maltophilia中，四个双组份系统Sm3706/Sm3705、Sm1829/Sm1828、Sm1911/Sm1912和Sm0737/0738涉及胞内第二信使环二鸟苷酸(cyclic diguanylate，c-di-GMP)代谢。分别敲除4个响应蛋白发现，Sm3705减少菌株FF11低温下78-82％胞外酶活性，Sm1828减少50-53％，Sm1912减少了10-15％，Sm0737无影响。酶谱分析显示，敲除Sm3705完全消除了SmtP的产生，与Δclp菌株具有相似的性状，敲除Sm1828明显减少了SmtP的产生。Sm3706/Sm3705是一个新的未被鉴定的双组份系统，能够响应低温的刺激，命名为LotS/LotR(low temperature sensor and regulator);LotS是一个非经典的感应激酶，LotR是一个响应蛋白，此蛋白包含了与c-di-GMP代谢有关的GGDEF和EAL结构域及信号接收的REC结构域。LotS/LotR与Clp都能够调控smtP的表达，表明LotS/LotR与Clp处在同一个调控smtP表达的信号传导系统中;ΔlotR和ΔlotS菌株中clp启动子活性及表达分析表明，Clp是LotS/LotR下游的调控蛋白。重组表达LotR体外检测发现，LotR不能合成，也不能降解c-di-GMP。胞内c-di-GMP检测表明，高温生长增加S.maltophilia FF11中的c-di-GMP的水平，而ΔlotR菌株中的c-di-GMP的浓度并不表现明显的高温依赖性的特征，表明LotR参与了温度调控的c-di-GMP水平。ITC结果显示，S.maltophilia FF11中的Clp与c-di-GMP亲和常数在25℃下为Kd=20.3±0.9nM，37C下Kd=22.7±1.1nM，表明嗜麦芽单胞菌中的Clp与c-di-GMP能够结合，而且温度对两者的结合能力没有明显影响。 (4)生物信息学分析显示，Sm1829/Sm1828与黄单胞菌中的双组份系统RpfC/RpfG具有较高的序列同源性。构建rpfF、rpfC及rpfG敲除菌株及各自的回补菌株，验证S.maltophilia FF11中RpfC/RpfG同样响应DSF分子调控胞外酶的活性。rpfC及rpfG的敲除对菌株的生长没有影响，却显著减少了菌株FF11在低温下胞外蛋白酶的活性，酶谱结果显示，敲除菌株显著减少了SmtP的产生，表明RpfC/RpfG能够响应温度变化调控胞外蛋白酶的产生。在低温培养下，缺失信号分子DSF明显减少了胞外蛋白酶的活性，在37℃下外源添加DSF或者过表达RpfF蛋白均不能增加胞外蛋白酶的活性，表明DSF仅在低温下能够调控胞外蛋白酶的表达。RpfG酶活性表明，S.maltophilia FF11中RpfG的活性依赖于DSF信号分子和低的生长温度两种信号。 综上，本论文分析了S.maltophilia FF11中外泌蛋白酶SmtP的主要特性，并解析了SmtP的一级结构序列;发现调控smtP表达的转录因子Clp及其上游调控因子LotS/LotR，并对LotS/LotR/Clp信号传导系统响应温度变化的机制进行了初步研究;发现S.maltophilia FF11中，RpfC/RpfG作为感应群体信号分子DSF的双组份系统，可同时响应温度刺激，共同调控胞外酶的产生。