禽大肠杆菌病是严重危害养禽业的细菌性传染病之一,因其复杂多变的血清型导致难以有效防控,对养禽业造成严重损失。同时,APEC作为人类肠外致病性大肠杆菌(ExPEC)的毒力基因贮存库,其携带的毒力基因可通过基因漂移进入食物链,间接对人类健康造成严重威胁。因此,加强对APEC的预防和控制具有重要的公共卫生学意义。生物被膜作为APEC的致病因子之一,它的形成能增强APEC抗宿主免疫系统和提高在环境中的生存能力,同时它还可以降低对抗菌药物的敏感性,进而增强了 APEC的致病性。这对预防和控制APEC提出了严峻的挑战,迫切需要开展与生物被膜的生理特征及致病性相关的研究。毒力调控因子通过毒力调控网络介导毒力相关基因的表达,进而影响细菌的致病性,这些毒力调控网络涉及细菌的分泌系统,二元调控系统等。大肠杆菌三型分泌系统2(ETT2)作为类似沙门氏菌SPI-1的一种分泌系统,它的出现使得APEC的致病机制变得更为复杂;phoP作为APEC二元调控系统的转录调节因子,它可以调节细菌的多种生命活动,然而,ETT2和phoP与生物被膜形成相关功能及致病机制尚不清楚。本文通过对ETT2和phoP在禽致病性大肠杆菌生物被膜形成和致病作用的研究,为进一步深入的了解禽致病性大肠杆菌的致病机制提供理论研究基础,最终为防控APEC感染提供新的治疗途径。主要研究内容如下:1.ETT2缺失对APEC生物被膜形成及致病性的影响为解析ETT2基因组分在APEC临床分离株中的分布规律,选择ECs3703和ECs3737作为ETT2毒力岛检测标志基因,同时检测含有ETT2的APEC菌株中ETT2的基因成分的完整性,结果发现64.4%(47/73)APEC临床分离株中含有ETT2毒力岛,其中含有ETT2毒力岛的O1血清型APEC菌株为14.9%(7/47),O2 血清型 APEC 菌株为 19.1%(9/47),O78 血清型 APEC 菌株为 10.6%(5/47),55.4%(26/47)为非“O1/O2/O78”血清型的 APEC 菌株。此外,APEC-ETT2 簇 eiv操纵子中存在8.8-kb难因缺失,其从eivJ(ecs3727)截断到eivF(ecs3734)。在此基础上,构建了 ETT2全基因簇的缺失株,实验结果表明缺失了 ETT2后,APEC生物被膜形成能力增强,对丁胺卡那和卡那霉素的耐药性增强,在热和氧化休克环境中的存活率显著增强,而在酸应激条件下存活率显著下降,同时,ETT2的缺失减少了鞭毛合成蛋白(flgN/flgM/fliR)和鞭毛丝成分基因(flgB/flgC/flgF)的转录水平表达量的显著下调,Ⅰ型菌毛基因表达量的上调,导致APEC的运动性下降,与DF-1细胞黏附性增强。此外,我们发现ETT2的缺失导致APEC的外膜组分LPS的完整性发生变化,细菌抗血清杀菌能力增强。为寻找ETT2是否分泌出效应蛋白,以及是否能影响其它分泌系统效应蛋白的表达分泌,通过分析ETT2缺失株与野生株的胞外分泌蛋白,结果表明缺失了 ETT2后,胞外分泌蛋白的表达量降低了,其成分包含了大量的鞭毛相关蛋白表达量下调,同时我们通过转录组数据发现了与T3SS相关的毒力效应蛋白的基因表达量也发生了变化,此外,ecs3717和ecs3718这两个ETT2的组分基因也发生了差异变化,在转录组数据中被注释为效应蛋白。这些研究结果为进一步了解ETT2的功能,解析其在APEC中的致病机制提供参考。2.ETT2分子伴侣ygeG在APEC生物被膜形成及致病性中的作用分析T3SS中分子伴侣对细菌分泌效应蛋白行使其致病性至关重要,但是ETT2中的分子伴侣功能尚未证实。在这里,我们通过生物信息学预测和鉴定了新的ETT2分子伴侣ygeG,构建了 ygeG基因缺失株和回复株。我们的实验结果表明,ygeG的缺失导致APEC生物被膜,运动性,在氧化应激条件下的存活率,细胞粘附及抗血清杀菌都出现了不同程度的增强,qRT-PCR结果显示与这些生命活动相关的基因的转录水平均呈现显著性上调,同时,ygeG的缺失导致抗逆性基因yhbO/hdeB转录水平下调,APEC在热休克,酸休克以及高渗环境中的存活率下降。此外,ygeG能影响T3SS效应蛋白基因espL/espX的转录水平。本研究证实了ygeG缺失后在APEC中所表现出的对细胞的生物学特性及毒力相关的影响与ETT2缺失后的实验结果非常相似,而且ygeG缺失后影响了 ETT2编码的yqeH(ecs3703)的转录水平上调,经分析yqeH为转录调节因子,这些结果表明,ygeG可负反馈调控转录调节因子yqeH的转录水平,通过yqeH调控下游靶基因的表达,最终贡献于ETT2的功能。3.ETT2转录调节子yqeH调控APEC生物被膜形成及致病性的分子机制ETT2存在于大多数大肠杆菌菌株中,并且在参与细菌致病性中起非常重要的作用。调节因子对ETT2发病机制的作用至关重要,但ETT2调节因子的功能尚未完全证实。在这里,我们显示yqeH,一种属于LuxR家族的新转录调节因子。我们开展了相关工作来研究ETT2-yqeH在APEC中的作用,我们构建了 yqeH基因缺失株和回复株,实验结果表明yqeH缺失降低了 APEC的生物被膜形成及运动性,涉及多个与生物被膜形成相关的基因和鞭毛组装基因的转录水平下调,p-半乳糖苷酶试验和EMSA证实了yqeH调控的靶基因fliT与APEC的运动性相关,yqeH调控的靶基因lsrF与APEC生物膜的形成相关,我们还发现APEC40-yqeH通过影响生物被膜形成和调节应激抗性基因的转录来影响不同环境中细菌的存活率。此外,我们的研究表明,APEC40-△yqeH菌株与DF-1细胞的粘附性降低是由于yqeH的缺失减少了Ⅰ型菌毛的转录水平。同样,我们发现yqeH的突变体减少了 O-抗原形成蛋白基因的转录,这可能是血清抗性缺陷的原因。它可能为分析ETT2参与细菌性败血症的机制提供依据。这些发现表明ETT2调节因子yqeH参与APEC的生物被膜形成,运动和致病性。4.PhoP调控APEC生物被膜形成及致病性的分子机制本研究基于前期实验室已构建的phop缺失株,并进行了相关工作的基础上,发现phoP缺失后影响了脂多糖途径中与糖链相关的基因合成,从而影响细菌细胞表面的疏水性和自身凝集。此外,phoP可以调节细菌鞭毛和卷曲菌毛的菌毛蛋白的组装,从而影响生物被膜的形成。最终,phoP缺失影响了细菌的多重耐药性。为了进一步解析phoP在APEC中的生物被膜形成及致病机制,通过基因芯片的表达谱数据筛选出差异基因tolC,结合生物信息学预测出phoP结合序列的特异性序列标识,并采用EMSA进行了验证,结果显示phoP可直接结合tolC的启动子。在此基础上构建了 tolC的缺失株和回复株,通过结晶紫染色去量化生物被膜形成以及观察rdar形态的改变,结果也证明了 tolC的缺失会降低生物被膜的形成,这也进一步阐明phoP影响细菌生物被膜形成的作用机制。phoP的缺失会降低APEC对雏鸡的致病性,phoP调控的靶基因tolC发挥了重要作用。我们通过攻毒雏鸡,观察病变组织和病理切片,结果也证明tolC的缺失后,雏鸡包心,肝脏、脾脏肿大的症状减轻,对宿主细胞的致病性下降,qRT-PCR结果发现,tolC的缺失影响了 T2SS分泌毒力效应蛋白元件的基因secA/ecB/secE/secy转录水平发生下调。我们的结果揭示了 phoP影响APEC生物被膜形成及对雏鸡致病性的作用机理,为全面认识禽致病性大肠杆菌致病机制提供参考。综上,本文从大肠杆菌三型分泌系统2(ETT2)和二元调控系统转录调节子phoP入手,阐明了 ETT2和phoP在APEC生物被膜形成以及致病性中的作用机制,即ETT2分子伴侣ygeG可负反馈调控转录调节因子yqeH的转录水平,通过yqeH调控下游靶基因的表达,最终贡献于ETT2参与APEC的生物被膜形成和致病性;转录调节因子phoP通过调控靶基因tolC影响APEC生物被膜的形成和致病性。这些研究结果为进一步揭示APEC的致病机制提供理论参考。