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Poria cocos(Schw.)Wolf为多孔菌科真菌,其干燥菌核茯苓是一种常见的真菌类药材,其主要活性成分包括茯苓三萜、茯苓多糖等,具有多种药用功效。目前,以松木为培养料的人工栽培是获取茯苓的主要方式,大量的茯苓需求在一定程度上加剧了森林资源的破坏,而寻求新的方式获取茯苓酸以及其它活性成分成为实现茯苓产业可持续发展的研究热点之一。利用合成生物学技术通过生物发酵是实现这一目标的重要途径。细胞色素P450(cytochrome P450)广泛分布于生物体内,参与从能量代谢到次生代谢物的代谢以及生物体的发育调控。目前,基于茯苓基因组和转录组数据推导的可能参与茯苓酸合成的部分催化酶基因已被确认,但仍有许多细胞色素P450氧化酶基因及其功能未被确认。本研究基于前期构建的茯苓菌核和菌丝转录组文库中发现的具有差异表达的细胞色素P450家族基因信息,克隆了PcCYP1和PcCYP3,并通过生物信息学分析、超表达技术、RNAi技术、真核表达技术对两个基因可能的功能进行了研究,为后期深入研究PcCYP1和PcCYP3的功能特性奠定了基础。取得的具体研究成果如下:1.从茯苓菌丝中克隆得细胞色素P450基因PcCYP1、PcCYP3以及PcCYP1的选择性剪切体PcCYP2的CDS序列,并进行了序列分析。PcCYP1、PcCYP2、PcCYP3的CDS长度分别为1590bp、1542bp、1581bp,分别编码529、513、526个氨基酸,均具有多个磷酸化位点。PcCYP1、PcCYP2第1-17氨基酸序列为信号肽,亚细胞定位于线粒体中,为分泌型不稳定的亲水蛋白,PcCYP3经跨膜区预测显示在N端存在跨膜区,亚细胞定位于质膜上,是稳定的亲水膜蛋白。PcCYP1、PcCYP2、PcCYP3与担子菌Coprinopsis cinerea的CYP502距离最近,且都含有CYP450保守结构域Fxx Gx Rx Cx G、Exx R、PER、AGx DTT。定量PCR结果显示,选择性剪接变体PcCYP2不同时期的表达量差异显著,因此推测PcCYP2可能对茯苓生长发育具有调控作用。2.成功构建了超表达载体p Blue Script SK-PcCYPs,通过PEG介导的原生质体转化方法成功转化到茯苓菌株GIM5.219中,并通过平板抗性筛选和抗性基因hph的扩增检测,分别获得了PcCYP1、PcCYP2和PcCYP3超表达菌株各3株。结合超表达菌株的PcCYP1、PcCYP2、PcCYP3表达量、菌落生长形态,三萜产物含量、菌丝活力等分析可知,PcCYP1、PcCYP2、PcCYP3超表达能使菌丝生长速率、茯苓酸含量、菌丝活力显著增加,但总三萜的含量与对照相比无差异。3.成功构建了沉默表达载体p Blue Script SK-PCIT-PcCYPs,并获得茯苓PcCYP1沉默表达转化子1株,茯苓PcCYP3沉默表达转化子6株,其中目的基因表达量显著降低的转化子其菌丝生长速率以及茯苓酸含量均显著降低,因此,进一步验证PcCYP1、PcCYP3对菌丝生长和茯苓酸的合成具有调控作用。4.构建了分泌型真核表达载体p PICZα-PcCYPs和胞内表达载体p GAPZC-PcCYPs,并转化到毕赤酵母X33菌株中进行异源表达,经SDS-PAGE分析,PcCYP1、PcCYP2、PcCYP3初步实现了在毕赤酵母中分泌表达,但表达量较低,为下一步开展体外酶促反应打下了基础。以上研究初步揭示PcCYP1、PcCYP2、PcCYP3参与到茯苓的生长发育以及茯苓酸的合成,为后期通过体外催化功能分析深入揭示其功能奠定基础,同时为研究其它茯苓未知功能的CYP450基因提供了一种思路。