在对细菌获得性免疫机制进行了近10年的研究后,科学家们发现了存在于所有古细菌中的CRISPR/Cas系统,它可以破坏外来入侵的遗传物质,从而保护自身遗传物质的稳定。基因编辑器CRISPR/Csa9可以体外靶向编辑目的基因,建立特定的疾病动物/细胞模型。然而,脱靶效应仍然是该系统的主要问题。Cas9蛋白不同结构域位点的突变构成了不同的亚型,在功能上也产生了一定的影响。其中,Cas9-D10A是由Ruv C结构域的D10A位点突变产生的一种Cas9蛋白的亚型。与野生型的Cas9蛋白不同,传统的Cas9蛋白只切割一条DNA链,产生可以修复的单链断裂而不会诱导插入缺失,这意味着脱靶产生双键断裂（doublestrand breaks,DSB）的可能性非常小。几项独立研究清楚地表明,由成对的切口酶产生的脱靶效应的频率比针对两个sg RNA位点中任一个的脱靶率低几个数量级。帕金森病（Parkinson’s disease,PD）是世界排名第二的神经退行性疾病,PD的治病因素有很多,其中家族遗传性PD占了10%～15%。在众多引起PD的基因中,PINK1基因占了所有家族遗传PD中的6%,对于研究PD的发病、发展以及治疗来说,家族遗传性PD是非常好的研究平台。PINK1基因包含8个外显子,是编码581个氨基酸的蛋白质。PINK1蛋白主要定位于在线粒体中,它在调节线粒体质量控制中起关键作用。通常情况下,PINK1蛋白可以促进呼吸线粒体网络的维持,并通过自噬调节选择性地降解受损或异常的线粒体。随着使用不同PINK1转基因动物模型的建立及相应研究,越来越多的证据支持线粒体自噬损伤对包括PD、阿尔茨海默症（Alzheimer disease,AD）、亨廷顿氏症（Huntington’s disease,HD）肌萎缩侧索硬化症（amyotrophic lateral sclerosis,ALS）、眼部疾病等在内的多种疾病的贡献。非人灵长类（non-human primates,NHP）与人类共享许多对提高认知能力至关重要的大脑区域、回路和细胞类型。此外,NHP具有更高的认知和社会交流能力,可以通过复杂的行为（包括面部识别、注视和发声）来表达,这些行为与人类更相似,并且难以在啮齿类或其他动物中进行研究。因此,NHP有望成为更好的动物模型,用于研究脑疾病中相关回路和行为功能障碍。基于以上背景,本研究利用Cas9-D10A基因编辑器来完成猴模型的构建。Cas9-D10A工作时需配合一对sg RNA使用,这可以帮助减少脱靶效率。结合已发表的研究,我们选取PINK1的2号外显子作为编辑位点,并设计筛选出配对的sg RNAs。我们发现在合子期胚胎中Cas9-D10A m RNA和sg RNA的注射并不会对胚胎发育产生影响,该系统在猴胚胎上的编辑效率在45.5%左右。移植注射Cas9-D10A编辑后的胚胎入代孕母猴体内,我们得到了3只PINK1靶向突变的猴模型。在对猴模型的评估过程中发现,尽管3只小猴在DNA和RNA水平上检测到了PINK1不同程度的降低,但是蛋白组学上并未发现异常,同时小猴也并未表现出PD相关症状。已经证实PINK1蛋白的缺失会引起线粒体自噬的发生。因此我们将突变猴的体细胞重编程为诱导多能干细胞（induced pluripotent stem cells,i PSCs）,在i PSCs分化为DA神经元的过程中我们发现,扫描电子显微镜下可以看到突变i PSCs来源的DA神经元中的出现了更多的线粒体异常,而在WT组中几乎没有看到类似的情况。我们推测PINK1突变对DA神经元的线粒体功能造成了一定的损伤。