灰飞虱Laodelphax striatellus(Fallen)属于半翅目飞虱科,是水稻上的重要害虫。由于化学农药的不合理施用,灰飞虱对多种杀虫剂产生了抗药性。抗药性机制的研究是抗性治理和害虫防治的基础。本实验室前期通过药剂筛选分别建立了抗毒死蜱、抗溴氰菊酯和抗吡虫啉灰飞虱品系;并通过抗、感品系的比较寻找到多个在转录水平上高表达的解毒酶基因。其中,CYP6AY3v2和CYP353D1v2的表达量在上述三个灰飞虱抗性品系中都有显著的上调。因此,本文进一步利用转基因技术,将CYP6AY3v2和CYP353D1v2转入果蝇体内进行超量表达,解析基因的功能,弄清与代谢抗性的关系。研究结果总结如下:1.转基因果蝇品系的构建及目标基因表达量分析构建转基因载体 pUAST-attB-CYP6AY3v2 和 pUAST-attB-CYP353D1v2,利用显微注射的方法将上述载体分别导入果蝇胚胎,通过筛选和纯化获得纯合的转基因果蝇品系UAS-CYP6A Y3v2 UAS-CYP353D)1v2。通过 GAL4/UAS 系统,将带有β-tubulin 强启动子的tub-ga14果蝇品系分别与UAS-CYP6AY3v2和UAS-CYP353D1v2杂交,获得全身超量表达灰飞虱CYP6AY3v2和CYP353D)1v2基因的果蝇品系tub>CYP6AY3v2和tub>CYP353D1v2。利用实时荧光定量PCR的方法,检测了超量表达目标基因的实验组果蝇和未启动目标基因过量表达的对照组果蝇中CYP6AY3v2和CYP353D1v2基因的表达量。结果显示:实验组果蝇中灰飞虱CYP6AY3v2和CYP353D)1v2基因的表达量分别是对照组表达量的65.42倍和60.24倍。同时,也检测了实验组和对照组果蝇中与目标基因序列相似的果蝇内源基因的表达情况。结果显示:果蝇内源相似基因表达量在实验组和对照组中无显著性差异(P>0.05),且其表达量显著低于目标基因的表达量。因此,灰飞虱CYP6AY3v2和CYP353D1v2基因在果蝇中得到了超量表达,果蝇内源的相似CYP不会对目标蛋白产生干扰作用。2.转基因果蝇对不同杀虫剂的敏感性测定通过农药生物测定的方法进一步研究转灰飞虱CYP6AY3v2和CYP353D1v2基因的果蝇与杀虫剂解毒代谢的关系。结果表明:超量表达灰飞虱CYP6AY3v2的果蝇品系tub>CYP6AY3v2时吡虫啉的抗药性有提高,抗性倍数为1.54;对毒死蜱和溴氰菊酯的抗药性未见提高。超量表达灰飞虱CYP353D1v2的果蝇品系tub>CYP353D1v2对吡虫淋和阿维菌素的抗药性显著提高,抗性倍数分别为10.35和14.13;对溴氰菊酯和毒死蜱的抗药性明显提高,抗性倍数分别为2.02和1.56。因此,灰飞虱CYP6AY3v2基因参与吡虫啉的解毒代谢;CYP353D)1v2基因参与吡虫啉、毒死蜱、溴氰菊酯和阿维菌素多种药剂的解毒代谢,是灰飞虱对多种杀虫剂产生交互抗性的机制之一。综上所述,本文通过果蝇超量表达技术验证了灰飞虱CYP64Y3v2和CYP353D1v2基因与杀虫剂解毒代谢的关系,为昆虫的代谢抗性研究提供了转基因技术平台。