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背景
阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)是一种进展性神经退行性疾病，在临床上的特征性表现为认知障碍、失用症、失认症和精神行为异常。细胞凋亡导致的大量神经元死亡是AD的病理生理学基础，但发病机制至今仍未明确。
微小RNA(miRNA)能够通过促进mRNA的降解或抑制其翻译的负调节作用对基因的表达进行调节。miRNA在细胞增殖、分化、凋亡和衰老等一系列过程中起重要作用。此外，miRNA的失调也可能与神经退行性疾病密切相关。miR-429是miR-200家族成员之一，据报道其在AD的发病机制中发挥着重要作用。在本研究中，我们将测定AD患者全血中miR-429的表达水平；并采用AD小鼠模型和Aβ诱导的小鼠皮质神经元模型研究miR-429对AD的作用和机制。
目的：本课题探究临床患者全血中miRNA的表达情况及miR-429与AD的相关性；在动物及细胞实验中探究Aβ对miR-429表达水平的影响，并寻求靶基因进行预测和验证。旨在了解miR-429在Aβ诱导的神经毒性中的作用机制，进而为AD临床诊断及靶向治疗提供可靠依据。
方法
1、按照严格的入组标准，选取2016年8月至2019年2月就诊于郑州人民医院神经内科病房或门诊的22例AD患者及26例健康体检人群纳入研究。收集并分析其一般资料及MMSE、Hachinski缺血量表、汉密尔顿抑郁量表、日常生活能力评估量表等。并从外周全血中提取miRNA，运用荧光定量PCR技术分析各组中miR-429的表达。
2、完成动物模型及细胞模型的构建，APPswe/PS△E9双转基因小鼠及对照组小鼠解剖脑组织。然后，在-80℃冷冻保存。从17d龄小鼠中分离出原代皮质神经元，将无脑膜的皮质消化成单层细胞后培养，用不同浓度的Aβ25-35(0μm，5μm，10μm，20μm)刺激皮质神经元24h。用qRT-PCR评估普通小鼠及转基因小鼠miR-429及SOX2和BCL2的mRNA表达水平。并对不同浓度Aβ25-35刺激的皮质神经元的miR-429的mRNA表达水平、细胞活性、细胞凋亡水平进行检测。
3、利用生物信息学软件在线数据库Targetscan分析miR-429的内源性靶标，构建重组质粒，并将重组质粒及miR-429共转染到皮质神经元中。应用双荧光素酶实验，检测皮质神经元中的荧光素酶活性。应用qRT-PCR及WB检测靶基因BCL2、SOX2的mRNA及蛋白表达水平。
4、采用SOX2过表达质粒(pcDNA-SOX2)提高SOX2的表达。应用RT-PCR、WB分别检测SOX2的mRNA及蛋白表达情况。再依次对皮质神经元的细胞活性、细胞凋亡水平进行检测。
5、将抗miR-429+si-对照或抗miR-429+si-BCL2转染皮质神经元。应用RT-PCR、WB分别检测BCL2的mRNA及蛋白表达情况。再依次对皮质神经元的细胞活性、细胞凋亡水平进行检测。
结果
1、AD病例组与对照组的一般特征中，性别(P=0.655)、年龄(P=0.582)、受教育程度(P=0.358)与对照组差异无统计学意义，MMSE评分(P=0.015)、Hachinski缺血量表评分(P=0.021)，CDR值(P=0.003)与对照组有显著差异。miR-429在AD病例组与对照组中表达差异具有统计学意义(P=0.028)。
2、AD小鼠模型和Aβ诱导的小鼠皮质神经元中miR-429升高，SOX2和BCL2降低。APPswe/PS△E9小鼠的大脑皮质中miR-429水平显著高于对照组(t=20.71，F=8.412，df=30)。APPswe/PS△E9小鼠的SOX2和BCL2mRNA水平较对照组低(t=14.41，F=1.286，df=30;t=14.44，F=1.006，df=30)。qRT-PCR分析显示，实验组miR-429表达显著上调，而SOX2mRNA和BCL2mRNA水平在Aβ诱导的皮质神经元中以浓度依赖性方式下调(F=523.1，56.35，54.01)。高浓度的Aβ可导致细胞凋亡率升高。
3、使用在线数据库TargetScan预测SOX2mRNA和BCL2mRNA的3-UTR含有miR-429的推定结合位点。将SOX2和BCL2的3-UTR与miR-429模拟物或miR-对照共转染到皮质神经元中。含有SOX23-UTR-WT或BCL23-UTR-WT的报告基因的荧光素酶活性被miR-429模拟物共转染显著抑制(t=22.42，F=2.25，df=10;t=13.02，F分别为=2.778，df=10)。在miR-429上调后，含有SOX23-UTR-MUT或BCL23-UTR-MUT的报告基因的荧光素酶活性几乎没有变化(t=1.339，F=1.563，df=10，p=0.2102;t=0.573，F=7.111，df=10，p=0.5791。WB示，miR-429上调抑制SOX2和BCL2表达水平(t=13.96，F=1.563，df=10;t=13.85，F=2.041，df=10)。miR-429敲除后，其表达水平增加(t=16.33，F=5.325，df=10;t=20.11，F=4.41，df=10)。
4、引入pcDNA-SOX2，SOX2表达显著增强(t=8.139，F=4.529，df=10)。SOX2过表达促进细胞活性(t=10.17，F=3.361，df=10)，抑制细胞凋亡(t=9.798，F=1.778，df=10)和Capase-3活性(t=21.01，F=1.44，df=10)。在用Aβ刺激之前，单独用抗miR-429或与SOX2特异性siRNA(si-SOX2)共转染。WB显示抗-miR-429+si-SOX2组中SOX2表达水平低于抗miR-429组(t=13.28，F=1.361，df=10)。SOX2表达的恢复显著逆转了抗miR-429对Aβ诱导的皮质神经元的神经保护作用，表现为细胞活性降低(t=10.03，F=3.063，df=10)，细胞凋亡(t=5.435，F=2.25，df=10)和Caspase-3活性(t=14.15，F=1.563，df=10)增加。
5、Aβ刺激前用抗miR-429+si-对照或抗-miR-429+si-BCL2转染皮质神经元。抗miR-429和si-BCL2的共转染导致BCL2表达减少并且显著地消除了抗miR-429对BCL2表达的影响(t=12.81，F=1.96，df=10)。BCL2水平的恢复显著逆转了抗miR-429介导的神经保护作用，表现为较低的存活率(t=7.842，F=1.563，df=10)，细胞凋亡率(t=5.365，F=1.563，df=10)和Caspase-3活性(t=17.21，F=1.563，df=10)增高。
结论
AD患者外周全血中miR-429的表达较正常人上升。在Aβ诱导的小鼠皮质神经元中miR-429增高，而SOX2和BCL2降低。敲除miR-429可通过靶向基因SOX2和BCL2来降低Aβ诱导的神经元损伤。
阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)是一种进展性神经退行性疾病，在临床上的特征性表现为认知障碍、失用症、失认症和精神行为异常。细胞凋亡导致的大量神经元死亡是AD的病理生理学基础，但发病机制至今仍未明确。
微小RNA(miRNA)能够通过促进mRNA的降解或抑制其翻译的负调节作用对基因的表达进行调节。miRNA在细胞增殖、分化、凋亡和衰老等一系列过程中起重要作用。此外，miRNA的失调也可能与神经退行性疾病密切相关。miR-429是miR-200家族成员之一，据报道其在AD的发病机制中发挥着重要作用。在本研究中，我们将测定AD患者全血中miR-429的表达水平；并采用AD小鼠模型和Aβ诱导的小鼠皮质神经元模型研究miR-429对AD的作用和机制。
目的：本课题探究临床患者全血中miRNA的表达情况及miR-429与AD的相关性；在动物及细胞实验中探究Aβ对miR-429表达水平的影响，并寻求靶基因进行预测和验证。旨在了解miR-429在Aβ诱导的神经毒性中的作用机制，进而为AD临床诊断及靶向治疗提供可靠依据。
方法
1、按照严格的入组标准，选取2016年8月至2019年2月就诊于郑州人民医院神经内科病房或门诊的22例AD患者及26例健康体检人群纳入研究。收集并分析其一般资料及MMSE、Hachinski缺血量表、汉密尔顿抑郁量表、日常生活能力评估量表等。并从外周全血中提取miRNA，运用荧光定量PCR技术分析各组中miR-429的表达。
2、完成动物模型及细胞模型的构建，APPswe/PS△E9双转基因小鼠及对照组小鼠解剖脑组织。然后，在-80℃冷冻保存。从17d龄小鼠中分离出原代皮质神经元，将无脑膜的皮质消化成单层细胞后培养，用不同浓度的Aβ25-35(0μm，5μm，10μm，20μm)刺激皮质神经元24h。用qRT-PCR评估普通小鼠及转基因小鼠miR-429及SOX2和BCL2的mRNA表达水平。并对不同浓度Aβ25-35刺激的皮质神经元的miR-429的mRNA表达水平、细胞活性、细胞凋亡水平进行检测。
3、利用生物信息学软件在线数据库Targetscan分析miR-429的内源性靶标，构建重组质粒，并将重组质粒及miR-429共转染到皮质神经元中。应用双荧光素酶实验，检测皮质神经元中的荧光素酶活性。应用qRT-PCR及WB检测靶基因BCL2、SOX2的mRNA及蛋白表达水平。
4、采用SOX2过表达质粒(pcDNA-SOX2)提高SOX2的表达。应用RT-PCR、WB分别检测SOX2的mRNA及蛋白表达情况。再依次对皮质神经元的细胞活性、细胞凋亡水平进行检测。
5、将抗miR-429+si-对照或抗miR-429+si-BCL2转染皮质神经元。应用RT-PCR、WB分别检测BCL2的mRNA及蛋白表达情况。再依次对皮质神经元的细胞活性、细胞凋亡水平进行检测。
结果
1、AD病例组与对照组的一般特征中，性别(P=0.655)、年龄(P=0.582)、受教育程度(P=0.358)与对照组差异无统计学意义，MMSE评分(P=0.015)、Hachinski缺血量表评分(P=0.021)，CDR值(P=0.003)与对照组有显著差异。miR-429在AD病例组与对照组中表达差异具有统计学意义(P=0.028)。
2、AD小鼠模型和Aβ诱导的小鼠皮质神经元中miR-429升高，SOX2和BCL2降低。APPswe/PS△E9小鼠的大脑皮质中miR-429水平显著高于对照组(t=20.71，F=8.412，df=30)。APPswe/PS△E9小鼠的SOX2和BCL2mRNA水平较对照组低(t=14.41，F=1.286，df=30;t=14.44，F=1.006，df=30)。qRT-PCR分析显示，实验组miR-429表达显著上调，而SOX2mRNA和BCL2mRNA水平在Aβ诱导的皮质神经元中以浓度依赖性方式下调(F=523.1，56.35，54.01)。高浓度的Aβ可导致细胞凋亡率升高。
3、使用在线数据库TargetScan预测SOX2mRNA和BCL2mRNA的3-UTR含有miR-429的推定结合位点。将SOX2和BCL2的3-UTR与miR-429模拟物或miR-对照共转染到皮质神经元中。含有SOX23-UTR-WT或BCL23-UTR-WT的报告基因的荧光素酶活性被miR-429模拟物共转染显著抑制(t=22.42，F=2.25，df=10;t=13.02，F分别为=2.778，df=10)。在miR-429上调后，含有SOX23-UTR-MUT或BCL23-UTR-MUT的报告基因的荧光素酶活性几乎没有变化(t=1.339，F=1.563，df=10，p=0.2102;t=0.573，F=7.111，df=10，p=0.5791。WB示，miR-429上调抑制SOX2和BCL2表达水平(t=13.96，F=1.563，df=10;t=13.85，F=2.041，df=10)。miR-429敲除后，其表达水平增加(t=16.33，F=5.325，df=10;t=20.11，F=4.41，df=10)。
4、引入pcDNA-SOX2，SOX2表达显著增强(t=8.139，F=4.529，df=10)。SOX2过表达促进细胞活性(t=10.17，F=3.361，df=10)，抑制细胞凋亡(t=9.798，F=1.778，df=10)和Capase-3活性(t=21.01，F=1.44，df=10)。在用Aβ刺激之前，单独用抗miR-429或与SOX2特异性siRNA(si-SOX2)共转染。WB显示抗-miR-429+si-SOX2组中SOX2表达水平低于抗miR-429组(t=13.28，F=1.361，df=10)。SOX2表达的恢复显著逆转了抗miR-429对Aβ诱导的皮质神经元的神经保护作用，表现为细胞活性降低(t=10.03，F=3.063，df=10)，细胞凋亡(t=5.435，F=2.25，df=10)和Caspase-3活性(t=14.15，F=1.563，df=10)增加。
5、Aβ刺激前用抗miR-429+si-对照或抗-miR-429+si-BCL2转染皮质神经元。抗miR-429和si-BCL2的共转染导致BCL2表达减少并且显著地消除了抗miR-429对BCL2表达的影响(t=12.81，F=1.96，df=10)。BCL2水平的恢复显著逆转了抗miR-429介导的神经保护作用，表现为较低的存活率(t=7.842，F=1.563，df=10)，细胞凋亡率(t=5.365，F=1.563，df=10)和Caspase-3活性(t=17.21，F=1.563，df=10)增高。
结论
AD患者外周全血中miR-429的表达较正常人上升。在Aβ诱导的小鼠皮质神经元中miR-429增高，而SOX2和BCL2降低。敲除miR-429可通过靶向基因SOX2和BCL2来降低Aβ诱导的神经元损伤。