论文部分内容阅读
目的:卵巢癌是女性妇科肿瘤中较常见的恶性肿瘤，分化程度低，深度浸润和转移是导致患者预后差的主要原因。治疗卵巢癌的首选方案是手术切除肿瘤细胞后并进行药物化疗实时监测。但是随着化疗的进行，肿瘤细胞会逐渐的产生耐药性，影响治疗效果，进而大大降低了术后患者的生存时间。研究显示，使卵巢癌发生耐药的因素包括:作用在癌旁组织的药物浓度下降、靶向接触药物的位点异常、DNA受损后难以正常恢复、调控凋亡途径的相关基因突变等均与卵巢癌抗药相关。因此，明确卵巢癌的耐药机制是改善卵巢癌患者术后生存率的关键。 S100蛋白家族是一类分子量较小的Ca2+结合蛋白家族，介于9-13kDa之间，在硫酸铵中易溶解，是EF手摸序结构。其家族成员在组织中的表达具有特异性。S100家族成员较多，不同的成员之间在不同的组织中其功能也不尽相同。S100家族成员中的S100A14，含有4个外显子，3个内含子，能够编码104种氨基酸，位置在染色体的1q21.3，由于染色体的频繁重组和放大，从而导致对S100A14的表达缺失，S100A14可能与肿瘤的发生发展、转移和侵袭、以及患者的预后相关。S100A16的自身特性与其他S100家族成员不同。结构上，在C端S100A16由高度保守的12个氨基酸构成，与S100家族中大部分成员EF端相一致。但在N端位置缺少谷氨酸盐残基和由氨基酸组成的loop环，S100A16的独特自身结构对于钙的调节位点非常重要。 利用基因芯片筛选，我们发现S100A14和S100A16在卵巢癌耐药细胞中表达明显升高，推测可能与肿瘤耐药相关。一些S100蛋白添加到细胞外，能够引起相应的内源性蛋白易位。最近，S100蛋白成为主要的与一些疾病相关的因素，如炎症、神经退行性病变及癌症等。S100A14和S100A16是S100家族中的两个成员，在多种肿瘤细胞中都呈现表达异常。S100A14基因在直肠癌和肾癌中的表达呈下调趋势，而在膀胱癌、乳腺癌和子宫的恶性肿瘤中呈现上调趋势。研究显示，在多种卵巢癌细胞系中S100A14呈现高表达状态，提示S100A14在治疗卵巢癌耐药方面可能是潜在标志分子。S100A16在乳腺癌、卵巢癌和肺癌中也呈高表达状态。为了证明S100A14和S100A16与卵巢癌的耐药特性以及其他生物学行为是否相关，我们进行了一系列的实验研究。 S100A14和S100A16在卵巢癌敏感细胞中几乎不表达，但是在卵巢癌耐药细胞中呈高表达状态。下调卵巢癌耐药细胞的S100A14和S100A16的表达后，可以部分恢复耐药细胞的药物敏感性，同时也影响着卵巢癌耐药细胞的增殖、迁移、凋亡和周期。进一步的实验结果提示S100A14和S100A16影响了卵巢癌耐药细胞的耐药性可能是通过Bax、Bcl-2、Bcl-xl、P-gp和GST-π途径共同调控的。本研究的结果和结论表明，通过体外实验研究探讨了卵巢癌耐药细胞的耐药机制，为临床上治疗卵巢癌耐药提供理论依据。 研究方法:1、培养不同的卵巢癌敏感细胞(A2780)和卵巢癌耐药细胞(A2780/Tax)。2、利用siRNA转染A2780/Tax，制备S100A14和S100A16低表达的细胞系、阴性对照的A2780/Tax细胞系以及对照组A2780/Tax细胞系。3、应用MTT法检测A2780和A2780/Tax细胞系耐药特性。4、应用平板克隆、MTT检测A2780/Tax细胞系的增殖特性。5、应用Transwell检测A2780/Tax细胞系的细胞迁移。6、应用流式细胞分析仪检测A2780/Tax细胞系的细胞凋亡和细胞周期。7、应用基因芯片筛选技术和实时定量PCR检测A2780和A2780/Tax细胞系的基因表达水平。8、应用Western blot检测A2780和A2780/Tax细胞系的蛋白表达水平。 结果:1、利用RT-PCR、Western blot验证S100A14和S100A16在卵巢癌敏感细胞中几乎不表达，但在卵巢癌耐药细胞中高表达。2、利用RT-PCR、Western blot证实转染si-RNA后S100A14和S100A16在A2780/Tax的表达降低。3、敲低S100A14和S100A16后使A2780/Tax对紫杉醇的耐药性降低。4、敲低S100A14和S100A16表达抑制A2780/Tax的增殖和迁移。5、敲低S100A14和S100A16表达促进细胞凋亡。6、敲低S100A14和S100A16表达，紫杉醇处理后G2/M期阻滞作用增强。 结论:在卵巢癌耐药细胞中，S100A14和S100A16均呈高表达状态，而在卵巢癌敏感细胞中却几乎不表达。下调S100A14和S100A16及两者联合下调后可以增加药物敏感性，抑制了细胞增殖能力和迁移能力，促进了细胞的凋亡，使细胞周期发生改变。S100A14和S100A16调控卵巢癌耐药细胞的耐药性可能是通过Bax、Bcl-2、Bcl-xl、P-gp、GST-π途径共同实现的。下调S100A14和S100A16及两者联合下调后，P27表达增高，提示卵巢癌患者的预后较好。