手足口病(Hand,foot and mouth disease,HFMD)是由多种肠道病毒(Enterovirus,EV)引起的一种常见于5岁以下儿童的急性传染病。近年来,手足口病在我国呈持续性散发或暴发态势,有大量研究表明非EV71非CVA16的其他肠道病毒取代了 EV71和CVA16的主要地位,逐渐成为引起手足口病的优势病原。由于其他肠道病毒的型别多种多样,单一或混合感染情况复杂多变,这给手足口病病原的准确诊断带来了极大挑战。另外,在手足口病重症和轻症病例中,EV71/CVA16/其他肠道病毒通用型检测均为阴性的病例数逐渐增多,其病原信息尚不明确,也尚无相关研究报道。因此应用一种精准的诊断技术来阐明手足口病重症与轻症病例的病原谱信息极为迫切和必要。二代测序技术作为精准医学的主流手段,不依赖于已知序列信息,可对某一生境中的所有微生物核酸序列进行并行测序和深入细致全貌的分析,尤其适用于病原复杂的手足口病。但因其运行成本高昂、操作繁琐、数据分析瓶颈和临床样本中的高背景问题,难以在临床诊断中推广使用。本研究首先利用分子条形码标识寡核苷酸引物(随机六聚体和非核糖体六核苷酸)和一管式无片段化DNA池文库的策略,建立了操作简便、成本低廉、直接鉴定病毒的快速二代测序平台。采用三种已知病毒进行模式试验,结果显示,分子条形码标识的寡核苷酸引物能够捕获到病毒序列信息,其中非核糖体六核苷酸引物捕获到的病毒序列占比和获得的模式病毒短序列的基因组覆盖度均稍高于随机六聚体引物。这表明非核糖体六核苷酸引物更适合用于病毒样本的检测。进而,利用20份手足口病临床样本对基于分子条形码标识非核糖体六核苷酸引物的二代测序平台进行验证分析,结果显示,该方法能准确捕获到手足口病病毒病原信息并对其进行型别鉴定,同时还能鉴定出其他潜在病毒和甄别临床误诊事件。这些结果表明,基于分子条形码标识寡核苷酸引物的二代测序平台直接鉴定临床样本的病毒病原切实可行。为全面了解手足口病重症与轻症病例的病毒病原谱信息,以分析重症与轻症病例在病原构成上的差异和试图探索引起重症病例的病原学因素,本研究应用以上建立的二代测序平台分别对94份重症病例和150份轻症病例临床样本进行了测序分析。结果显示,手足口病样本中的病毒信息覆盖了哺乳动物病毒科和植物病毒科共 13 种病毒科的成员:Picornaviridae,Caliciviridae,Paramyxoviridae,Orthomyxoviridae,Parvoviridae,Astroviridae,Adenoviridae,Reoviridae,Anelloviridae,Virgaviridae,Alphaflexiviridae,Tymoviridae 和 Tombusviridae。其中,轻症病例的病毒组分比重症病例更为复杂。在轻症病例中检测到源于12个病毒科的38个病毒,而在重症病例中则检测到源于7个病毒科的21个病毒。同时,在手足口病样本中还检测出了多种肠道病毒不同型别之间、肠道病毒与非肠道病毒之间的混合感染事件。所有病毒均通过分子生物学方法进行再次验证,经卡方检验对病毒阳性检出病例数进行统计学分析,发现肠道病毒与呼吸道相关病毒的共存事件易发生于手足口病重症病例(P=0.001),而肠道病毒与引起腹泻相关病毒的共存事件易发生于轻症病例(P<0.001)。另外,利用生物信息学方法对二代测序数据组装获得的札如病毒全基因组序列进行了系统发育分析,进化树表明这株病毒为我国当前的流行毒株。总之,本研究成功建立了直接鉴定病毒的二代测序平台,首次对随机六聚体引物和非核糖体六核苷酸引物捕获病毒信息的能力进行了比较分析,并应用该平台首次初步阐明了手足口病重症与轻症病例的病毒病原谱,揭示了引起手足口病的肠道病毒多样性和混合感染的复杂性,为手足口病的临床诊断提供了一种精准检测方法,也为手足口病病原和相关疫情的确诊初步提供了数据支持和参考依据,对手足口病的预防控制具有重大意义。