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目的:套细胞淋巴瘤(MCL)是一种具有独特临床病理特征的B细胞非霍奇金淋巴瘤(B-NHL),大多数患者在临床就诊时就已多属晚期,常规治疗难以达到根本治愈。现阶段,世界范围内MCL尚无标准的一线治疗方案。临床上治疗方案的选择通常基于年龄、体能状况积分以及预后危险度分层等多因素综合判断。虽大多数患者对大剂量密集型化疗方案如R-CHOP方案或R-hyper-CVAD等化疗方案有效,但化疗相关毒副作用大,治疗相关死亡率高,且大部分患者最终会复发、耐药。异基因造血干细胞移植(Allo-HSCT)是目前唯一有可能治愈MCL的方法,但移植相关死亡率较高,且多数患者缺乏HLA匹配的供者,导致Allo-HSCT在临床上难以大范围实施;因此寻找有效治疗MCL的新药物和新方法迫在眉睫。西达本胺是一种新型的组蛋白去乙酰化酶抑制剂(Histone deacetylase inhibitor,HDACi),它通过提高细胞内组蛋白的乙酰化水平,进而调控基因的表达而产生细胞周期阻滞、促进细胞凋亡等生物学效应,发挥抗肿瘤作用;硼替佐米(Bortezomib,BTZ)是一种蛋白酶体抑制剂,可通过下调Cyclin D1表达、抑制NF-Kb途径等机制发挥抑制肿瘤细胞生长、播散及血管生成等,发挥抗肿瘤作用。因其毒副作用小,且与常规化疗药物无交叉耐药性而备受临床瞩目。近年来,体内外实验均证实了蛋白酶体抑制剂单药或组蛋白去乙酰化酶抑制剂单药对实体瘤(如肺癌、大肠癌、卵巢癌)和血液系统恶性肿瘤(如白血病、淋巴瘤等)均具有治疗作用,且据相关文献报道显示HDACi可通过增强对NF-Kb活性的抑制而发挥与BTZ协同抗肿瘤作用,但两者联合作用对MCL的增殖抑制及凋亡影响,国内外鲜有报道。本实验通过体外细胞培养技术,分别应用西达本胺、硼替佐米单药以及两药联合对人套细胞淋巴瘤细胞株(Jeko-1细胞、Grant-519细胞)进行处理,然后观察各组细胞增殖抑制程度以及凋亡作用的影响,并探索其可能的作用机制,为将来临床上采用西达本胺联合硼替佐米治疗复发难治MCL提供理论依据。方法:1人套细胞淋巴瘤细胞株(Jeko-1细胞,Grant-519细胞)的体外培养及传代人套细胞淋巴瘤细胞株Jeko-1细胞、Grant-519细胞购自中国科学院上海细胞库,将上述两种细胞接种于含有20%胎牛血清(以色列BI公司),1%青-链霉素混合液的RMPI 1640(美国Gibco公司)培养基,然后置于37℃、5%CO2的培养箱中培养,每2-3天传代一次,取对数生长期细胞用于后继实验。台盼兰拒染法证实实验活细胞率在95%以上。2 CCK-8法检测西达本胺、硼替佐米及两药联合分别作用于Jeko-1细胞,Grant-519细胞对细胞增殖的影响取Jeko-1细胞、Grant-519细胞悬液,随机分为空白对照组、阴性对照组、不同浓度西达本胺单药组、不同浓度硼替佐米单药组及二药联合组,分别作用24h,48h及72h后观察Jeko-1细胞及Grant-519细胞生长抑制情况;应用金正均公式计算联合用药是相加、协同还是拮抗作用。3流式细胞术Annexin V/PI标记法检测西达本胺、硼替佐米单药及两药联合作用于Jeko-1细胞和Grant-519细胞对细胞凋亡率的影响取Jeko-1细胞及Grant-519细胞悬液,随机分为西达本胺组、硼替佐米组、西达本胺+硼替佐米组、对照组,培养箱中孵育48h后收集细胞,按BD凋亡试剂盒步骤进行。4 RT-PCR法检测西达本胺、硼替佐米及两药联合作用于Jeko-1细胞和Grant-519细胞对NF-Kb(p65)、Bcl-2、Bax、CCND1及Caspase3/9m RNA表达水平的影响取Jeko-1细胞及Grant-519细胞悬液,随机分为西达本胺组、硼替佐米组、西达本胺+硼替佐米组、对照组,培养箱中孵育48h后收集细胞,根据Trizol法提取RNA、c DNA反转试剂盒、实时荧光定量PCR试剂盒具体实验操作步骤检测NF-Kb(p65)、Bcl-2、Bax、CCND1及Caspase3/9 m RNA的表达水平。5 Western Blot法检测西达本胺、硼替佐米及两药联合作用于Jeko-1细胞和Grant-519细胞对NF-Kb(p65)、Bcl-2、Bax、CCND1及Caspase3/9蛋白表达水平的影响取Jeko-1细胞及Grant-519细胞悬液,随机分为西达本胺组、硼替佐米组、西达本胺+硼替佐米组、对照组,培养箱中孵育48h后收集细胞,提取各组细胞的总蛋白,取50ug(或20ug)蛋白上样,SDS-PAGE电泳,印迹转膜后,分别加入抗NF-Kb(p65)、Bcl-2、Bax、CCND1、Caspase3/9抗体孵育,后加入二抗,用双色红外激光扫描仪进行扫膜成像。结果1 CCK-8法检测西达本胺、硼替佐米单药及两药联合对Jeko-1细胞和Grant-519细胞增殖的影响1.1西达本胺单药对Jeko-1细胞、Grant-519细胞增殖的影响人套细胞淋巴瘤株Jeko-1细胞、Grant-519细胞分别经不同药物浓度(0.50、1.00、2.00、4.00、8.00、16.00μM),(4.00、8.00、16.00、32.00μM)的西达本胺作用24h、48h、72h后,应用CCK-8法检测吸光度值均有不同程度的降低;在相同处理时间下,随着药物浓度的加大,Jeko-1细胞、Grant-519细胞抑制率逐渐升高;在相同药物浓度下,随着作用时间的延长,Jeko-1细胞、Grant-519细胞的抑制率亦逐渐升高,其效应呈时间和剂量依赖性。差异具有统计学意义(P<0.05),西达本胺对Jeko-1细胞、Grant-519细胞有抗增殖活性。1.2硼替佐米单药对Jeko-1细胞、Grant-519细胞增殖的影响人套细胞淋巴瘤株Jeko-1细胞、Grant-519细胞分别经不同药物浓度(0.25、0.50、1.00、2.00、4.00、6.00、8.00n M),(0.01、0.10、1.00、10.00μM)的硼替佐米作用24h、48h、72h后,应用CCK-8法检测吸光度值均有不同程度的降低;在相同处理时间下,随着药物浓度的加大,Jeko-1细胞、Grant-519细胞抑制率逐渐升高;在相同药物浓度下,随着作用时间的延长,Jeko-1细胞、Grant-519细胞的抑制率亦逐渐升高,其效应呈时间和剂量依赖性。差异具有统计学意义(P<0.05),硼替佐米对Jeko-1细胞、Grant-519细胞有抗增殖活性。1.3西达本胺联合硼替佐米对Jeko-1细胞、Grant-519细胞增殖的影响当西达本胺与硼替佐米联用时,Jeko-1细胞、Grant-519细胞的抑制率均较单药时明显升高,如4.00μM的西达本胺、0.01μM的硼替佐米、4.00μM西达本胺联合0.01μM硼替佐米作用于Grant-519细胞48h的细胞抑制率分别为(27.46±2.96)%、(6.58±1.10)%、(42.10±3.01)%;按金正均公式计算两药具有协同作用,Q值为1.31,与单药组、对照组相比差异具有统计学意义(P<0.05)。2流式细胞术Annexin V/PI标记法检测西达本胺、硼替佐米单药及两药联合作用于Jeko-1细胞和Grant-519细胞对细胞凋亡率的影响:在一定浓度范围内,西达本胺及硼替佐米单药均可诱导Jeko-1细胞和Grant-519细胞凋亡,随着药物浓度增高,细胞凋亡率升高;当两药联合作用时细胞凋亡率明显增加。差异具有统计学意义(P<0.05)。3 RT-PCR方法检测西达本胺、硼替佐米及两药联合作用于Jeko-1细胞和Grant-519细胞后NF-Kb(p65)、Bcl-2、Bax、CCND1及Caspase3/9m RNA表达水平变化:在一定浓度范围内,西达本胺组随着药物浓度的递增,作用48h后Jeko-1细胞和Grant-519细胞表达Bcl-2、CCND1 m RNA量减少,表达Bax、Caspase3/9 m RNA量增加(P<0.05),而NF-Kb(p65)m RNA表达量与对照组相比无显著性差异(P>0.05);在硼替佐米组,NF-Kb(p65)、Bcl-2、CCND1 m RNA的表达量均随药物浓度增加而降低,Bax、Caspase3/9 m RNA随药物浓度的增加表达量升高(P<0.05);西达本胺联合硼替佐米组均可显著下调NF-Kb(p65)、Bcl-2、CCND1 m RNA表达量,上调Bax、Caspase3/9 m RNA表达量,与对照组、单药组比较差异具有统计学意义(P<0.05)。4 Western Blot法检测西达本胺、硼替佐米及两药联合作用于Jeko-1细胞和Grant-519细胞后NF-Kb(p65)、Bcl-2、Bax、CCND1及Caspase3/9蛋白表达的影响:西达本胺或硼替佐米单药均可下调Bcl-2及CCND1蛋白的表达,上调Bax及Caspase3/9蛋白的表达,此外硼替佐米单药组还可下调NFKb(p65)蛋白的表达,当两药联合作用时,可下调NF-Kb(P65)、Bcl-2及CCND1蛋白的表达,上调Bax及Caspase3/9蛋白的表达,与对照组相比差异具有统计学意义(P<0.05),与之前RT-PCR结果相符。结论:1西达本胺、硼替佐米单药及两药联合均对Jeko-1细胞和Grant-519细胞有抑制增殖、诱导凋亡的作用,在一定浓度范围内,呈时间-剂量依赖性,两药联合作用增强;2在一定浓度范围内,西达本胺联合硼替佐米可下调CyclinD1、NF-Kb(p65)和Bcl-2基因及蛋白的表达,上调Bax及caspase3/9基因及蛋白的水平,较单药作用增强,说明西达本胺联合硼替佐米抑制Jeko-1细胞和Grant-519细胞增殖,诱导其凋亡的机制可能与下调Cyclin D1、NF-Kb(P65)的活性及激活Caspase3途径相关。