背景：骨关节炎(osteoarthritis, OA)是在机械性和生物学因素共同作用下,主要导致关节软骨丢失和软骨下骨改变的一种慢性退行性疾病。目前认为：年龄、体重、性别及力线不良等因素都是骨关节炎的主要危险因素。正常关节软骨由大量细胞外基质(Extracellular matrix, ECM)和极少而唯一的细胞成分——软骨细胞构成。生理状况下,软骨细胞外基质处于一种低水平的合成和降解的动态平衡,稀疏分布的软骨细胞对维持细胞外基质的稳态至关重要。当各种因素导致软骨细胞外基质合成减少,而分解增加,使关节软骨代谢处于一种负性失衡状态,则可导致骨关节炎发病。过去几十年里,有关骨关节炎的研究层出不穷,尤其是大量基因改造动物被广泛用作骨关节炎研究的动物模型,使人们对OA的认识得到了极大提高。可遗憾的是,OA的发病机制至今尚未阐明。更可惜的是,目前临床对OA缺乏有效防治措施,大多严重OA患者最终被迫接受昂贵的、大创伤、高风险且疗效有限的关节置换术。因此,进一步研究OA的发病机制,对于正确指导其临床防治至关重要。先前,开展了大量有关多不饱和脂肪酸(Poly Unsaturated Fatty Acids, PUFAs)与OA的研究,涉及了动物及临床等体内外实验。结果一致认为：外源性添加n-3多不饱和脂肪酸,而不是n-6多不饱和脂肪酸,可促进软骨ECM合成,抑制其降解,改善OA的症状,延缓OA的发病。更深入的研究表明：n-3多不饱和脂肪酸可抑制白介素-1(Interleukin-1,IL-1)和肿瘤坏死因子-a(Tumor necrosis factor-α TNF-α)等促炎因子介导的蛋白降解酶表达,如基质金属蛋白酶(Matrix metalloproteinases,MMPs), A disintegrin and metalloproteinase with thrombospondin motifs-4,5(ADAMTS-4,5)等,它们直接参与软骨ECM降解。此外,n-3 PUFAs还可通过抑制环氧合酶-2(Cyclooxygenase-2, COX-2)和脂氧合酶(Lipoxygenase, LOX)途径,减轻滑膜炎症,而改善OA症状。尽管如此,目前有关内源性n-6和n-3 PUFAs的构成比,尤其是关节软骨中n-6和n-3PUFAs的构成比,与OA的相关研究未见报道。既往研究主要关注外源性n-6或n-3PUFAs对软骨细胞代谢及OA的影响。而众所周知,哺乳动物,尤其是人类的饮食结构复杂多样,食物中n-6和n-3 PUFAs的含量和比例均相差甚远。且PUFAs在体内的生物转化反应受基因多态性及酶活性影响,存在底物竞争效应。综上所述,我们认为：内源性n-6和n-3 PUFAs的构成更值得关注。因此,通过在动物体内过表达fat-1基因,该基因来源于线虫,编码脂肪酸去饱和酶,能将内源性n-6 PUFAs转变成n-3 PUFAs,从而改变n-6和n-3 PUFAs的构成比,对于客观全面研究PUFAs与OA关系意义重大。哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR,the mammalian target of rapamycin)是整合细胞内外各种信号,调控细胞生长代谢及自噬的关键通路。目前发现有两种不同的mTOR复合物：mTOR复合物1(mTOR complex 1, mTORC1)和mTOR复合物2(mTOR complex 2, mTORC2)。雷帕霉素是一种被广泛应用于器官移植抗排斥反应的大环内酯内类抗生素,可与细胞内FK506结合而特异性mTORC1的活性,但不能抑制mTORC2的活性。由于雷帕霉素这种特异性抑制剂的存在,导致人们对mTORC1的作用研究和认识较多,而对mTORC2的作用了解甚少。mTORC1是调控细胞生长代谢的中心信号分子,也是调节细胞自噬的关键分子。研究表明:mTORC1主要通过整合IRS-1/PI3-kinase/Akt和AMP-activated protein kinase等上游信号,磷酸化抑制其下游ULK1/ATG13/FIP200蛋白复合物,而抑制细胞自噬。目前认为：自噬是细胞进行能量再利用的重要途径,通过溶酶体工厂降解细胞内自噬小体,清除细胞内受损或废用的生物大分子及细胞器。当细胞处于低能量或应激等状态时,自噬对于维持细胞存活起至关重要作用。最近研究表明：自噬是正常关节软骨细胞发挥功能的重要保证,其功能受损是OA发病的重要因素之一。给不稳诱导OA的小鼠灌胃Rapamycin,可通过特异性抑制关节软骨细胞mTORC1通路活性,激活其自噬功能,从而显著改善OA发病。以上研究表明：mTORC1信号通路可能参与调控OA发病,但其具体机制尚有待于进一步研究。我们前期研究和预实验结果表明：AA可激活mTORC1通路活性,而DHA不仅能抑制mTORC1通路活性,还能竞争性抑制AA对mTORC1通路的激活作用。结合最近Carames等人的研究发现：雷帕霉素可通过抑制mTORC1信号通路延缓OA发病。因此,我们提出以下科研假说：改变内源性n-6和n-3多不饱和脂肪酸的构成比,可能通过影响软骨细胞mTORC1信号通路活性及其调控细胞自噬的功能,从而影响骨关节炎发病。为了验证以上科研假说,本实验旨利用fat-1转基因小鼠模型,首次重点研究内源性n-6和n-3 PUFAs构成比与骨关节炎发病的关系,以及mTORC1通路在此过程中的调控作用。为OA的防治提供新观点和新靶点。目的：本实验旨在fat-1转基因小鼠体内,首次探讨改变n-6和n-3 PUFAs的构成比对OA的影响,及其与调节细胞自噬关键通路mTORC1的关系。为今后临床使用n-3 PUFAs防治OA发病提供更客观和全面的科学依据。方法：本实验共选取8周龄体重在20-23克的fat-1转基因(TG)和野生型(WT)对照雌鼠各24只,选择手术切除右膝关节内侧半月板(DMM, destabilization of medial meniscus)导致膝关节不稳诱导OA的小鼠模型,左膝关节仅切开皮肤作为假手术对照组(Sham)。造模后4周和8周两个时间段,随机处死小鼠,收集血清及膝关节标本。用气相色谱方法分析小鼠不同组织中n-6/n-3 PUFAs含量和构成比。通过酶联免疫吸附(ELISA)法检测造模后小鼠血清中系统性促炎因子(白介素-1β,肿瘤坏死因子-a)及OA相关蛋白(透明质酸,血清淀粉样蛋白A)的表达水平。并利用小动物显微CT、扫描电镜、组织学及组织化学等方法系统评估造模后OA发病情况。此外,体外分离培养小鼠原代关节软骨细胞,使用气相色谱方法分析原代细胞中PUFAs的含量的构成。用免疫印迹的方法检测外源性PUFAs及改变内源性n-6/n-3 PUFAs的构成后,对软骨细胞mTORC1通路活性及自噬的影响。另外,通过IL-1β刺激软骨细胞构建体外炎症模型,检测软骨细胞炎症因子的表达水平,以观察PUFAs对软骨细胞相关功能的影响。所有数据均以mean±SD表示,数据处理通过SPSS13.0软件完成,两独立样本均数相比较时,使用两样本t检验；配对样本均数相比较,使用配对t检验,设P<0.05为差异有统计学意义。结果：1、TG小鼠n-6和n-3 PUFAs的构成得到优化,OA造模后关节中PUFAs的含量发生变化首先,我们比较TG与WT小鼠鼠尾、血清和透明软骨中n-6和n-3 PUFAs含量及构成的差别。结果发现,与WT小鼠相比,TG小鼠各组织中内源性n-3PUFAs的含量显著升高,而n-6 PUFAs的含量明显降低,且n-6/n-3 PUFAs比例显著降低(P<0.001)。这表明：TG小鼠不仅在血清和鼠尾中,更关键的是,在关节软骨中优化了内源性n-6和n-3 PUFAs的含量和构成。此外,本实验还首次观察了OA造模后,小鼠膝关节中n-6和n-3 PUFAs含量的变化。有趣的是：我们发现造模后4周和8周,WT和TG的DMM组n-3 PUFAs的含量均显著升高(P<0.001),而n-6 PUFAs的含量也轻度升高,差异有统计学意义(P值分别为0.009,0.014)。以上结果表明：TG小鼠不仅可降低内源性n-6 PUFAs的含量,还可升高内源性n-3 PUFAs的含量,从而优化内源性PUFAs的构成；且OA造模术后,膝关节中内源性n-3 PUFAs的含量增加。2、OA造模后,与WT小鼠相比,TG小鼠骨关节炎血清学相关指标改善。本实验通过ELISA的方法,检测OA造模后8周,小鼠血清中促炎因子IL-1p、TNF-α和软骨降解相关蛋白HA、SAA的水平,从而反应骨关节炎的严重程度。结果显示：OA造模术后8周,TG小鼠和WT小鼠血清中IL-1β、TNF-α、HA和SAA的含量均显著上升。但两者相比,TG小鼠造模后血清中IL-1β、TNF-α、HA升高程度显著低于WT小鼠(P<0.001)；而造模后血清中SAA升高程度,两组显著无统计学意义(P=0.843)。以上结果表明：OA造模术后,与WT小鼠相比,TG小鼠血清中促炎因子的水平降低,软骨降解相关蛋白升高程度减小。3、造模后TG小鼠骨关节炎进展延缓为了全面评估TG和WT小鼠造模后膝关节退变及骨赘增生情况。标本经Micro-CT扫描重建后,用mimics 5.0软件标记并计算环膝关节骨赘体积和表面积。结果显示：TG小鼠在术后4周和8周膝关节周围骨赘体积和表面积较WT小鼠显著减小。为了进一步观察造模后关节软骨微观结构,在扫描电镜下观察胫骨平台软骨。结果显示：WT小鼠关节软骨负重区出现了大面积的软骨皲裂、剥脱及软骨下骨暴露,且合并软骨下骨微骨折。而TG小鼠仅表现为负重区关节软骨皲裂和浅表性撕脱。以上结果充分说明：优化内源性n-6和n-3 PUFAs的构成,可减轻关节软骨病变,减少关节骨赘增生,延缓OA发病。4、造模后TG小鼠软骨蛋白聚糖和软骨细胞的丢失程度较轻为确证内源性PUFAs可保护保护关节软骨,延缓OA发病。我们对石蜡切片行番红O-快速绿染色,并进行关节软骨细胞计数和Mankin评分。结果显示：与TG小鼠相比,WT小鼠关节软骨细胞数量显著减少,Mankin评分显著增加(P值均<0.001)。高倍镜结果显示：WT小鼠潮线基本消失且排列紊乱,而TG小鼠潮线未见明显变化。同时行甲苯胺蓝染色评估关节软骨厚度,结果显示：与TG小鼠相比,WT小鼠关节软骨磨损严重,软骨厚度显著变薄(P<0.001)。以上结果说明：优化内源性n-6和n-3 PUFAs比例,可减轻OA造模后软骨蛋白聚糖和软骨细胞的丢失。5、造模后TG小鼠关节软骨中ADAMTS-5和MMP-13阳性细胞比例减少软骨ECM的降解是伴随OA发病的重要环节,也是导致关节软骨破坏的直接原因。为了观察内源性PUFAs在此过程中的作用,我们对切片进行免疫组化检测。选择在软骨ECM的降解过程中,起关键作用的蛋白水解酶：MMP-13和ADAMTS-5,前者主要降解Ⅱ型胶原,后者是降解蛋白聚糖的关键酶。结果显示：造模后WT小鼠关节软骨中MMP-13和ADAMTS-5阳性细胞比例均较TG小鼠显著增加(P值均<0.001)。综上结果表明：优化内源性n-6/n-3 PUFAs的构成可减少关节软骨中MMP-13和ADAMTS-5的表达,减轻关节软骨ECM降解。6、TG小鼠可抑制由于OA造模后导致的软骨细胞自噬功能受损既往的研究表明：n-3 PUFAs主要通过影响炎症介质的释放等途径,调控软骨细胞蛋白水解酶的产生。但内源性PUFAs是否可通过其他途径,影响关节软骨细胞的功能,目前尚不清楚。最近有研究提示：mTORC1信号通路活性调节的关节软骨自噬功能可能与OA的发病密切相关。本实验为了进一步探讨内源性PUFAs对软骨细胞自噬功能的影响。我们通过免疫组织荧光技术检测关节软骨细胞中自噬标志蛋白LC3 Ⅱ的表达水平,以反应造模后软骨细胞的自噬水平的变化。结果表明：OA造模后,TG和WT手术组关节软骨细胞中LC3 Ⅱ蛋白的表达均有不同程度的下降,但TG手术组软骨细胞中LC3 Ⅱ蛋白的表达显著高于WT手术组。以上结果表明：在OA造模后,可导致关节软骨细胞本身的自噬功能受损；优化内源性n-6和n-3 PUFAs的构成,可在一定程度上保护软骨细胞的自噬功能。7、PUFAs调节mTORC1信号通路影响软骨细胞自噬既往研究已阐述了PUFAs在OA发病中的作用,但未涉及mTORC1通路在此过程的作用。为探讨PUFAs在OA发病中与mTORC1信号通路的关系,首先,我们体外分离培养并鉴定原代软骨细胞。然后,通过氨基酸饥饿实验研究外源性PUFAs(DHA和AA)对软骨细胞mTORC1通路及自噬的影响。结果显示：AA可显著促进mTORC1下游核糖体S6蛋白磷酸化,并抑制细胞自噬蛋白LC3 Ⅱ的表达；而DHA则显著抑制]mTORC1下游核糖体S6蛋白磷酸化,并促进细胞自噬蛋白LC3 Ⅱ的表达,且DHA可拮抗AA的作用。这表明：外源性n-6 PUFAs可通过上调]mTORC1活性而抑制软骨细胞自噬,而n-3 PUFAs则表现出与之完全相反的作用,并可拮抗n-6 PUFAs的作用。最后,为研究内源性PUFAs在此过程中的作用,我们同时分离TG和WT小鼠软骨细胞,重复以上实验,得到类似结果。综上结果表明：增加内源性n-3 PUFAs的含量,减少n-6 PUFAs的含量,可下调mTORC1信号通路的活性,促进软骨细胞自噬功能。8、TG小鼠软骨细胞PUFAs构成与透明软骨中相似,且可减少由于IL-1p诱导的促炎因子表达。为了明确关节软骨细胞体外培养后,内源性PUFAs的构成是否和体内一致?本实验分别检测TG小鼠和WT小鼠原代软骨细胞中内源性PUFAs的构成,结果发现,与WT小鼠相比,TG小鼠软骨细胞中n-6 PUFAs含量显著降低,而n-3 PUFAs含量显著升高,n-6/n-3 PUFAs比例显著降低(P值均<0.001)。这一结果和透明软骨中PUFAs的检测结果基本相似。此外,通过向原代软骨细胞培养基中添加IL-1p刺激,结果发现：WT和TG小鼠软骨细胞TNF-α,IL-6和的PGE2分泌均增加；但TG小鼠的增加幅度较WT小鼠显著减小(P值均<0.001)。以上结果表明：体外分离培养后的TG小鼠原代关节软骨细胞,其内源性PUFAs构成稳定且被优化；优化内源性PUFAs构成后的软骨细胞可减轻由IL-1p介导的促炎效应。结论：综上所述：本实验首次阐述内源性n-6和n-3 PUFAs比例和OA的关系及mTORC1通路在此过程中的作用。我们的研究使用全身型表达fat-1基因的TG小鼠,选择不稳诱导的OA模型：一种广泛用于OA研究的动物模型。该实验结果尚有待于在其它模型(如老年自发性OA模型)或大型fat-1转基因动物模型(如猪,恒河猴等)中进一步验证。以进一步明确内源性PUFAs和OA的关系,更好地指导其临床治疗。总之,我们研究表明：增加内源性n-3 PUFAs的含量,减少n-6 PUFAs的含量,降低关节软骨中内源性n-6/n-3 PUFAs比例,可下调关节软骨细胞mTORC1信号通路的活性,提高软骨细胞自噬能力,促进软骨细胞存活及其功能,从而延缓OA发病。这一结果提示：在今后OA的防治中,应更加关注内源性n-6和n-3 PUFAs的构成所发挥的作用。