抑郁症是一种对人们生活乃至生命威胁极大的神经退行性疾病,预计到2020年,其将成为导致人类残疾负担的第二大诱因。虽然目前科学家和临床医生已为抑郁症的治疗付出巨大努力,但是在其诊断方法、病因、病理机制、治疗药物和预后等方面仍存在很多尚未明确的问题。此外,研究表明学习记忆障碍会加速抑郁症的病程,并且会使其预后更差,这对抑郁症的防治极为不利。因此,目前亟待新的抗抑郁药物问世,而兼顾改善学习记忆的药物可能会达到更佳的治疗效果。近年来的研究表明从天然产物中发现抗抑郁新药具有巨大潜力。木豆素(Cajaninstilbeneacid,CSA)是一种来源于木豆[Cajanus cajan(L.)Millsp.]叶的活性芪类化合物,其具有抗炎、抗氧化、增强神经可塑性等药理作用。前期研究表明CSA可以改善慢性不可预测性温和应激(chronic unpredictable mild stress,CUMS)引起的小鼠抑郁症状,对于Aβ1-42诱导的认知障碍也具有明显的改善作用。因此,我们推测CSA有可能成为治疗抑郁症的候选药物。本研究采用腹腔注射脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)、CUMS以及卵巢摘除(ovariectomy,OVX)模型,进一步深入研究CSA在抗抑郁和改善认知障碍方面的药理作用,并探讨其可能的作用机制,为CSA在抗抑郁新药的研发提供科学依据,也为其在认知障碍方面的开发提供基础。1.CSA改善LPS诱导的小鼠抑郁样行为及机制研究首先,采用不同剂量的LPS(0.32、0.8和2mg/kg)对C57BL/6J雄性小鼠腹腔注射以建立可靠的LPS致抑郁动物模型,并以糖水偏爱实验(sucrose preference test,SPT)、悬尾实验(tail suspension test,TST)和空场实验(open field test,OFT)进行抑郁样行为评价,采用尼氏染色观察神经元状态;采用免疫印迹实验(western blot,WB)测定神经可塑性相关蛋白(PSD-95和TrkB)水平;采用液相色谱-串联质谱联用技术(liquid chromatography-tandem mass spectrometry,LC-MS/MS)法测定 3-羟基犬尿氨酸(3-hydroxykynurenine,3-HK)和犬尿喹啉酸(kynurenic acid,KYNA)的含量;采用实时荧光定量-聚合酶链式反应(real-time fluorescence quantification-polymerase chain reaction,RT-qPCR)测定炎症因子 TNFα、IL-1β、IL-10 和 TGFβ 的mRNA水平;采用免疫组织化学染色(immunohistochemistry,IHC)观察小胶质细胞的激活状态。结果显示,与对照组相比,三个LPS注射组小鼠的糖水偏爱指数均显著降低;自主活动有不同程度的降低,但没有显著性差异;而0.8 mg/kg LPS剂量组的悬尾不动时间显著延长。对其进行机制初探后发现0.8 mg/kg剂量组小鼠的皮层和海马中的尼氏染色变浅,神经元排列松散,PSD-95和TrkB蛋白含量显著降低,3-HK含量显著升高,小胶质细胞显著激活,而另外两个剂量组的上述指标和对照组相比没有显著性差异。除此之外,我们发现2mg/kg剂量组小鼠的KYNA含量显著上升,而三个剂量组小鼠的IL-1β、TNFα和TGFβ的mRNA水平以及GFAP蛋白表达水平均呈现一定的剂量依赖性。综合以上结果,我们认为LPS可能通过调节不同胶质细胞的稳态来改变犬尿氨酸(KYN)通路的代谢水平,最终影响中枢神经系统的神经可塑性,本研究最终确定用于建立LPS致抑郁模型的LPS注射剂量为0.8 mg/kg。其次,采用所建立的LPS抑郁小鼠模型考察CSA(7.5、15和30mg/kg)灌胃给药三周对LPS抑郁模型小鼠的抗抑郁作用。通过SPT、TST和OFT行为学实验评价抗抑郁作用,采用尼氏染色观察神经元状态;采用WB测定神经可塑性相关蛋白(PSD-95、AP2、BDNF 和 TrkB)、炎症相关蛋白(p-IκB/IκB、p-p65/p65 和 GFAP)及自噬相关蛋白(p-mTOR/mTOR、p-ULK1/ULK1、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、p62 和 Beclin1)水平;采用LC-MS/MS法测定Trp及其代谢产物(5-HT、KYN、3-HK和KYNA)的含量;采用RT-qPCR测定相关炎症指标TNFα、IL-1β、IL-10、TGFβ、IDO和TLR4的mRNA水平。结果表明,CSA在三个剂量下对LPS模型小鼠的糖水偏爱指数没有显著影响,但在7.5和15 mg/kg剂量下可以显著缩短LPS模型小鼠的悬尾不动时间。对对照组、LPS模型组和CSA(15mg/kg)给药组小鼠皮层中的相关蛋白和代谢物分子进行检测后发现,和LPS模型组相比,CSA给药组小鼠皮层中的神经元排列变得紧密,PSD-95、AP2、BDNF和TrkB的蛋白表达显著增加,星形胶质细胞的激活受到显著抑制,TLR4/NF-κB信号通路下调,炎症因子IL-1β、TNFα和TGFβ的mRNA表达显著下降,5-HT的含量上调,KYN及3-HK的含量下调,自噬通路的Beclin1和LC3Ⅱ/LC3Ⅰ的表达上调,mTOR和ULK1的磷酸化下调,p62的蛋白表达显著下降。综合以上结果,我们认为CSA在LPS模型中发挥抗抑郁作用,可能是通过增强神经可塑性、平衡Trp代谢稳态、降低神经炎症以及增强自噬发挥作用。2.CSA改善CUMS诱导的小鼠抑郁行为及机制研究对Balb/c雄性小鼠给予CUMS刺激的同时每天口服给予CSA(7.5、15和30 mg/kg),6 周后采用 SPT、TST、强迫游泳实验(forced swimming test,FST)和新奇抑制摄食实验(novelty suppressed feeding test,NIF)评价小鼠的抑郁样行为,采用尼氏染色评价神经元的状态;采用WB测定神经可塑性相关蛋白(PSD-95、AP2、BDNF和TrkB)、炎症相关蛋白(p-IκB/IκB、p-p65/p65和GFAP)及自噬相关蛋白(p-mTOR/mTOR、p-ULK1/ULK1、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、p62 和 Beclin1)水平;采用 LC-MS/MS法测定Trp及其代谢产物(5-HT、KYN、3-HK和KYNA)的含量;采用RT-qPCR 测定相关炎症指标 TNFα、IL-1β、IL-10、TGFβ、IDO 和 TLR4 的 mRNA 水平;采用IHC观察小胶质细胞的激活状态;采用超高效液相色谱-四级杆-飞行时间质谱(ultra performance liquid chromatography-quadrupole-time of flight-mass spectrometry,UPLC-QTOF-MS)的代谢组学分析方法对小鼠血清的代谢轮廓进行分析。结果表明,CSA在15和30 mg/kg剂量下可以显著升高CUMS小鼠的糖水偏爱指数,在7.5和15mg/kg剂量下显著缩短悬尾不动时间,在15mg/kg剂量下显著缩短强迫游泳不动时间和新奇抑制摄食潜伏期。在TST和FST检测中的某些时段内,CSA给药组比阳性药阿米替林(10mg/kg)给药组的不动时间更短,其变化趋势更为平稳。对对照组、CUMS模型组和CSA(15mg/kg)给药组小鼠皮层中的相关蛋白和代谢物分子进行检测后发现,CSA可使CUMS模型小鼠的神经元损伤减少,PSD-95、AP2、BDNF和TrkB的蛋白表达显著增加,小胶质细胞和星形胶质细胞的激活受到抑制,TLR4/NF-κB通路下调,炎症因子IL-10、TNFα和TGFβmRNA的表达显著下降,Trp和5-HT的含量上调,KYN的含量下调,KYNA/3-HK的值升高,自噬通路的Beclin1和LC3Ⅱ/LC3Ⅰ的表达上调,mTOR和ULK1的磷酸化下调,p62的蛋白表达显著下调。代谢组学研究结果显示,CSA能明显逆转CUMS引起的小鼠血清中代谢物轮廓的部分改变,鉴定出了 16个生物标志物,包括去甲肾上腺素、多巴胺、二氢黄体酮、丙氨酸、黄嘌呤、二十碳三烯酸、牛磺酸、亚牛磺酸、半乳糖、胍乙酸等,涉及神经递质代谢、花生四烯酸代谢、牛磺酸与次牛磺酸代谢、半乳糖代谢、能量代谢和脂肪酸代谢等代谢通路。这些改变的代谢物和产前抑郁症、多巴胺β羟化酶缺陷症、GABA氨基转移酶缺乏症、黄嘌呤尿等疾病显著相关。综合以上结果,我们认为CSA在CUMS模型中发挥抗抑郁作用,可能是通过增强神经可塑性、平衡Trp代谢稳态、降低神经炎症、增强自噬以及逆转神经递质代谢、能量代谢等代谢通路发挥作用。3.CSA改善OVX小鼠的认知障碍和相关机制研究首先,考察小鼠OVX后不同时点认知功能的改变情况,以建立OVX小鼠认知障碍模型。ICR雌性小鼠在麻醉状态下施行OVX手术,术后2、4、8周时采用新物体识别实验(novel objectrecognition,NOR)和水迷宫(Morris water maze,MWM)实验对小鼠的学习记忆能力进行评价,采用WB测定神经可塑性相关蛋白(BDNF和TrkB)及自噬相关蛋白(ULK1和LC3Ⅱ/LC3Ⅰ)水平。结果表明,在OVX造模2周和4周时其新物体识别指数和空间记忆均没有受到显著影响,而在造模8周时小鼠的新物体识别指数显著降低,空间工作记忆受损。对小鼠海马中的相关蛋白进行检测后发现,OVX造模4周和8周时BDNF/TrkB信号通路显著下调,造模8周时自噬水平降低。因此,我们认为OVX造模8周可以较好地造成小鼠的认知障碍。其次,采用所建立的OVX模型,施行OVX手术后每天口服给予CSA(7.5、15和30 mg/kg),8周后通过NOR和MWM实验研究CSA对OVX模型小鼠认知障碍的改善作用,采用WB测定神经可塑性相关蛋白(PSD-95、AP2、BDNF和TrkB)、雌激素受体 α(estrogen receptor α,ERα)、炎症相关蛋白(p-IκB/IκB、p-p65/p65 和 GFAP)及自噬相关蛋白(p-mTOR/mTOR、p-ULK1/ULK1、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、p62和Beclin1)水平;采用LC-MS/MS法测定Trp及其代谢产物(5-HT、KYN、3-HK和KYNA)的含量;采用RT-qPCR测定相关炎症指标TNFα、IL-1β、IL-10、TGFβ、IDO 和 TLR4 的 mRNA 水平。结果表明,CSA可以显著提高OVX模型小鼠的新物体识别指数和显著缩短其在MWM工作记忆检测中的寻台潜伏期。CSA给药可以使OVX模型小鼠海马中PSD-95、AP2、BDNF和TrkB的蛋白表达显著增加,ERα表达显著上调,星形胶质细胞的激活得以抑制,炎症因子IL-10和TNFα的mRNA表达降低,TLR4/NF-κB信号通路下调,5-HT的含量上调,KYN及下游3-HK、KYNA的含量下调,3-HK/KYN的值减小,自噬通路中Beclin1和LC3Ⅱ/LC3Ⅰ的表达上调,mTOR和ULK1的磷酸化下调,p62的蛋白表达显著下调。综上,我们认为CSA在OVX模型中发挥改善认知障碍的作用,可能是通过增强神经可塑性、上调ERα表达、平衡Trp代谢稳态、降低神经炎症以及增强自噬发挥作用。综上,CSA在LPS及CUMS诱导的小鼠抑郁模型和OVX诱导的小鼠学习记忆障碍模型中分别发挥抗抑郁和改善认知障碍的药理作用,且其作用机制和增强神经可塑性、平衡Trp代谢稳态、降低神经炎症、增强自噬水平和上调ERα水平有关,可能涉及神经递质代谢、能量代谢、激素合成等代谢通路。本研究为CSA进一步的新药研发奠定基础。