目的：在世界范围内,肝细胞肝癌的发病率居肿瘤的第六位,在肿瘤致死的癌症中居第三位,仅次于肺癌与结肠癌。我国肝癌的发病率居世界第四位3,但我国肝细胞肝癌患者的数量居世界首位。近年来,肝细胞肝癌的发病率在西方国家较前有明显升高,由于对肝硬化患者进行普查,使30-60%的病人能够早期发现,并且接受手术治疗4。但多数病人就诊时已经是疾病中晚期并伴有严重的肝硬化,无法接受根治性治疗。即使病人可以接受手术治疗,由于肝细胞肝癌的高复发性、高转移性以及对化疗药物的耐药等,使得肝细胞肝癌的总体治疗效果很差。在恶性肿瘤的系统治疗中,化疗为最常用的治疗方法之一,并且部分肿瘤对化疗具有很好的敏感性,但是传统的化疗药物对于肝细胞肝癌基本无效5。有Ⅱ期临床实验报道单独应用吉西他滨可能对肝细胞肝癌无确切疗效6,但联合奥沙利铂等药物可能会对患者带来一定治疗效果7。因此,寻找一种有效的化疗药物及化疗辅助用药是提高肝细胞肝癌化疗敏感性的一种方法。聚集素(clusterin,CLU)是1983年由Blaschuk等从山羊睾丸组织液中提出的一种异二聚体糖蛋白8,一种以核型存在(nCLU),一种以分泌型存在(sCLU)。在多种恶性肿瘤的晚期或者转移肿瘤中,例如前列腺癌、膀胱癌等9,10,sCLU的表达升高,与肿瘤的发展及凋亡等过程有密切关系。在进行化疗及放疗时,sCLU表达升高,在抵抗化疗、放疗等外界因素导致的细胞凋亡中具有重要作用。sCLU的高表达导致了多种化疗药物的耐药,例如阿霉素、顺铂、依托泊甙、喜树碱等。我们最近的研究表明,sCLU在肝细胞肝癌奥沙利铂耐药机制中具有重要作用,抑制sCLU表达后,肝细胞肝癌对奥沙利铂的化疗敏感性明显增强,并且发现sCLU可能通过线粒体凋亡途径来调节肝细胞肝癌的化疗耐受性。在我们前期研究工作的基础上,本课题对肝细胞肝癌组织的sCLU表达情况以及sCLU与临床病理学指标的关系进行了研究,对sCLU联合吉西他滨对肝细胞肝癌细胞系的治疗效果进行了观察,并对sCLU在吉西他滨化疗中的作用机理进行了初步探讨。方法：1.利用免疫组化方法,检测肝细胞肝癌组织以及癌旁组织中sCLU的表达水平,应用免疫组化半定量计分,分析了sCLU的表达水平与肝细胞肝癌临床病理学指标之间的关系。2.用、Vestern blot方法检测人肝细胞系QSG7701,人肝癌细胞系HepG2、Bel7402、Bel7404、SMMC7721、Huh-7以及SUN739这7种细胞系中sCLU的表达情况,并筛选出sCLU高表达的人肝细胞肝癌细胞系Bel7402、SMMC7721进行下一步实验。3.根据sCLU的基因序列,设计4种干扰片段来封闭sCLU基因的表达,并插入到载体pMAGic7.1中,用RT-PCR进行鉴定,用Western blot筛选出干扰效率最强的载体shRNA CLU-4,并大量扩增,命名为sCLU-shRNA。4.对Bel7402、SMMC7721细胞系应用sCLU-shRNA以及吉西他滨进行干预,设置分组为对照组、sCLU-shRNA组、吉西他滨组、sCLU-shRNA+吉西他滨组,用CCK-8法检测细胞增殖情况,用流式细胞法检测细胞的凋亡情况。5.应用凋亡通路基因芯片(SABioscience)检测sCLU封闭前后Bel7402、 SMMC7721细胞系相关凋亡基因的表达变化,筛选出表达明显改变的基因,并对筛选出的(ADD45a以及Akt进行Western blot验证。6.构建GADD45a的过表达转染载体pcDNA3.1-GADD45a-His,并转染入Bel7402和SMMC7721细胞系,设置分组为GADD45a组、sCLU-shRNA组、吉西他滨组、GADD45a+吉西他滨组、sCLU-shRNA+吉西他滨组,用CCK-8方法检测细胞增殖情况,用流式细胞法检测细胞凋亡情况。7.建立稳定的细胞系Bel7402-sCLU-shRNA和SMMC7721-sCLU-shRNA并进行裸鼠成瘤,腹腔内注射吉西他滨,观察肿瘤体积变化,绘制肿瘤的生长曲线。并且利用TUNEL法对肿瘤组织进行细胞凋亡检测,计算凋亡指数。结果：1.肝细胞肝癌组织的sCLU表达明显升高,主要是胞浆表达,表达强度为高表达或者中度表达,癌旁组织中sCLU的表达水平则是低表达或者不表达。sCLU的表达水平与肝细胞肝癌的组织学分级及术前有否TACE有关。肿瘤细胞分化程度越差,sCLU表达水平越高,术前行TACE治疗者,sCLU的表达水平增高。2.sCLU在Bel7402细胞系中的表达水平最高,其次是SMMC7721、HepG2和Huh-7细胞系。筛选Bel7402、SMMC7721细胞系作为sCLU阳性表达肝细胞肝癌细胞系进行下一步实验。3.针对sCLU基因序列,设计4种基因片段来封闭sCLU的表达。对干扰基因片段经过、Western blot鉴定,发现CLU-4shRNA(sCLU-shRNA)具有最好的抑制效果,并且这种抑制效果呈现时间依赖性。在Bel7402及SMMC7721细胞系中发现,sCLU-shRNA作用48小时的抑制效果最好。4.空壳质粒及sCLU-shRNA对肝细胞肝癌细胞系的细胞活力无影响。吉西他滨对细胞活力的影响呈现剂量依赖关系。对照组、吉西他滨组、sCLU-shRNA组以及吉西他滨+sCLU-shRNA组,经过CCK-8检测发现,单独应用吉西他滨可以抑制Bel7402和SMMC7721细胞系的细胞生长(P<0.05),吉西他滨+sCLU-shRNA能够更加明显的抑制细胞的生长,结果具有显著差异(P<0.01)。流式细胞法检测结果与细胞活力检测结果基本一致,吉西他滨+sCLU-shRNA组细胞凋亡最多,吉西他滨组其次,并发现sCLU-shRNA组较对照组细胞凋亡增加(P<0.05)。5.应用人类凋亡特定通路基因芯片(SABioscience)检测发现,抑制sCLU表达后的细胞与对照组比较,有14种基因表达上调,除NOL3基因外,其余13种均为促凋亡基因(BAK1、Bcl2L1、BIK、BNIP1、Casp1、GADD45a、LTBR、 TNF、TNFRSF10A、TNFRSF25、TRADD、HRK、LTA)。基因下调者有4种,分别为Bag1、NAIP、Akt1、FASLG,其中前三种基因对凋亡具有抑制作用。进一步的Western blot分析证实,抑制sCLU表达后,GADD45a高表达,而磷酸化的Akt表达降低。6.应用CCK-8及流式细胞法检测发现,单独应用GADD45a和sCLU-shRNA对细胞生长基本无影响,两组之间未有差异。单用吉西他滨会抑制细胞生长,使凋亡增加,GADD45a+吉西他滨组及sCLU-shRNA+吉西他滨组均发现细胞生长受到明显抑制(P<0.01),凋亡细胞明显增加,并且在GADD45a+吉西他滨组,细胞生长受抑制最明显,细胞凋亡最多。7.裸鼠成瘤后,腹腔注射吉西他滨,测量肿瘤体积发现sCLU-shRNA+吉西他滨组肿瘤体积最小,吉西他滨组其次,两者与对照组之间有明显差异(P＜0.01),而单独应用sCLU-shRNA和对照组肿瘤体积最大,两者之间未有差异。应用TUNEL凋亡检测发现,sCLU-shRNA+吉西他滨组凋亡指数最大,吉西他滨组其次,两者之间有统计学差异(P<0.05),两组与对照组以及sCLU-shRNA组之间有明显差异(P<0.01)。结论：1.sCLU在肝细胞肝癌组织中呈高水平表达。肿瘤分化越差,sCLU表达水平越高,术前行TACE者,sCLU表达水平高。其表达水平与其他临床病理学指标无关。2.sCLU在肝细胞肝癌的化疗耐药中具有重要作用,抑制sCLU的表达可以增加肝细胞肝癌对吉西他滨化疗的敏感性。3.sCLU表达水平改变可以引起大量的凋亡相关基因的改变,推测sCLU在肿瘤细胞的凋亡过程中具有重要作用。4.sCLU表达的变化可以引起GADD45a以及pAkt表达的变化,并且GADD45a对于增加肝细胞肝癌对吉西他滨化疗敏感性具有重要作用。5.体内外研究显示,抑制sCLU可增强肝细胞肝癌化疗的敏感性,sCLU可能是研究肝细胞肝癌化疗的靶点之一。意义：1.研究了sCLU在肝细胞肝癌中的表达以及与临床病理学指标的关系。2.证实了抑制sCLU表达可以提高肝细胞肝癌对吉西他滨化疗的敏感性。3.发现了sCLU可能引起的凋亡通路中相关蛋白的改变,提示sCLU在细胞凋亡过程中可能具有重要意义。4.sCLU作为一个重要分子,对多种化疗药物起重要调节作用,为肝细胞肝癌的化疗研究提供新的靶点。