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钙拮抗剂和本课题组研发的碘化氮正丁基氟哌啶醇（N-n-butyl haloperidol iodide,F2）可阻断心肌细胞L-型钙通道，拮抗钙超载，减轻心肌缺血再灌注(ischemia-reperfusion,I/R)损伤。前期研究[1-2]及文献[3-4]报道，在心肌细胞缺氧复氧（hypoxia/reoxygenation,H/R）状态下，钙拮抗剂除了阻断L-型钙通道外，存在非L-型钙通道依赖地保护心肌细胞的作用。 iPLA2是磷脂酶A2家族的一亚族，能够水解膜磷脂，生成花生四烯酸（AA）和溶血磷脂，已经在心肌，平滑肌，肾小管上皮等组织中鉴定出来，其中，在心肌中有相对较高的活性，已有研究报道，iPLA2能够在磷脂的重塑、凋亡、血管舒缩的调节、细胞的增殖、心肌缺血等方面发挥重要的作用[5~7]，肌浆网内钙释放可以激活iPLA2且激活后发挥催化作用时不需要钙离子的参与。本论文为了研究钙拮抗剂的非L-型钙通道阻断作用，在建立心肌细胞胞外无钙H/R模型的基础上，观察iPLA2是否参与H/R损伤，钙拮抗剂通过iPLA2及相关信号通路抗损伤作用的机制。 方法： 1.通过Western blotting检测H/R时iPLA2蛋白表达和SOD活性的时效关系，确定实验H/R模型的时间点。 2.分别用激动剂LPS（或iPLA2质粒转染）和拮抗剂BEL（或SiRNA干扰）使iPLA2在H/R时高表达和低表达，检测氧自由基（SOD、MDA）、炎症（AA）和早晚期凋亡的变化，得出iPLA2的表达与无钙H/R的“因果”关系。 3.在H/R的基础上加上不同浓度的钙拮抗剂（F2、Ver、Dil、Nif），用RT-PCR，Western blotting及酶活性试剂盒检测iPLA2的表达，得出不同钙拮抗剂对iPLA2表达的影响；同时检测SOD、MDA、AA、MMP的变化，反映不同钙拮抗剂抗心肌细胞H/R损伤的作用。 4.在H/R的基础上用1×10-6M的钙拮抗剂进行处理后，孵育iPLA2的激动剂脂多糖（LPS），检测iPLA2的活性，同时检测SOD、MDA、AA的变化，来反映钙拮抗剂抗心肌细胞H/R损伤是否通过iPLA2实现。 5. Western blotting检测 iPLA2、PKA、c-fos、PKC、p-ERK、p-JNK、p53的表达，Elisa检测 cAMP的表达。探讨钙拮抗剂抗 H/R损伤是否通过H/R---PKC---iPLA2---ERK---JNK---p53或者 H/R---iPLA2---cAMP---PKA---c-fos信号通路实现。 结果： 1.与0Ca组比， H30min/R30min和H45min/R30min时， iPLA2蛋白显著高表达（P<0.05）；缺氧45min后，SOD活性持续降低（P<0.05）。 2.与H/R组比，转染iPLA2的质粒或孵育激动剂LPS后，iPLA2的蛋白和活性进一步升高(P<0.01)，SOD活性进一步下降，MDA和AA分泌也进一步增加，晚期凋亡显明加重（P<0.01）；用SiRNA或抑制剂BEL干扰iPLA2的表达后，iPLA2的mRNA和活性则进一步下降（P<0.05），SOD活性显著恢复，MDA和AA分泌亦显著减少，早晚期凋亡都得到抑制（P<0.01）。 3.与0Ca组比，H/R组iPLA2mRNA、蛋白、活性表达增加，SOD显著性下降，MDA和AA分泌显著增加，线粒体膜电位下降，早期凋亡加重（P<0.05），分别加上不同浓度的F2、Ver、Nif处理后，量效依赖地降低了iPLA2的表达（P<0.05）；同时，显著升高了SOD的活性，降低了MDA、AA的分泌，减轻了早起凋亡的发生（P<0.05）。而Dil对上述指标无影响（P>0.05）。 4.与H/R组比，分别加上1×10-6M的F2、Ver、Nif，iPLA2的表达降低，孵育激动剂LPS后，F2、Ver、Nif的作用不同程度地被抑制，显著地增加了iPLA2的表达，降低了SOD活性，增加了MDA和AA的分泌。（P<0.05） 5.与H/R组比，F2显著的降低了iPLA2、p-ERK、PKA、c-fos的表达，增加了cAMP的表达（P<0.05），对PKCδ、p-JNK的表达无影响（P>0.05）；Ver、Nif对cAMP、PKA， c-fos，PKCδ，p-ERK，p-JNK无影响（P>0.05）。 结论： 1. iPLA2参与了心肌细胞无钙H/R损伤，高表达和活性升高可加重损伤，低表达和活性降低可减轻损伤。 2.无钙H/R可引起iPLA2的高表达和活性升高，加重氧自由基的生成和炎症的发生，促进凋亡，F2、Ver、Nif可量效依赖地通过调控iPLA2的表达，减轻损伤。 3. H/R---iPLA2---cAMP---PKA---c-fos是F2通过iPLA2保护心肌细胞H/R损伤的信号通路之一，Ver、Nif对此通路无影响。