1研究目的本论文以经方“葛根芩连汤”作为研究对象,根据中药药效组分理论及其研究模式,研究与“葛根芩连汤”功能主治相对应的药效组分;并以有效性、安全性、稳定性为指标,研究和探讨葛根芩连汤药效组分质量评价体系。2研究内容与方法2.1葛根芩连汤药效组分研究本研究选择与葛根芩连汤传统经方记载一致,具有代表性的道地产区药材,对其品种进行鉴定后,按传统经方记载的加工炮制方法制成葛根芩连汤配伍饮片,再按照经典方剂葛根芩连汤饮片配伍比例(8:3:3:2)及传统水煎煮法进行葛根芩连汤供试品的制备。本研究选择传统制剂中实际存在、而且在单味药中研究较成熟和有相关药理作用(与复方功能主治相关)的14种化合物作为葛根芩连汤药效组分分析的对象,采用高效液相色谱法分析其药效组分,研究各药效组分的含量和比例关系。将初步确定的药效组分,选择与葛根芩连汤功能相对应的经典药理学验证实验,以及在前期研究证实并在大量相关研究中建议使用的与主治相对应的实验,对葛根芩连汤药效组分的有效性进行验证。最终确定与葛根芩连汤功能主治相一致的药效组分。2.2葛根芩连汤药效组分质量评价体系研究对研究确定的葛根芩连汤药效组分分别以有效性、安全性、稳定性为研究指标,进行质量评价体系的研究,最终初步建立葛根芩连汤药效组分质量评价体系。3研究结果3.1葛根芩连汤药效组分研究3.1.1葛根芩连汤药效组分分析葛根芩连汤中的14种药效组分,葛根素、大豆苷、大豆苷元、黄芩苷、汉黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素、盐酸小檗碱、盐酸巴马汀、盐酸药根碱、盐酸表小檗碱、盐酸黄连碱、甘草酸铵、甘草苷的含量范围(%)分别为1.6737±0.017、0.1533±0.004、0.0473±0.003、0.4480±0.026、0.0916±0.003、0.0123±0.003、0.0067±0.0、0.0955±0.004、0.0343±0.004、0.0438±0.001、0.0360±0.002、0.0483±0.003、0.1103±0.005、0.1580±0.004。3.1.2葛根芩连汤药效组分药理学辅助验证试验3.1.2.1与功能相关的实验(1)解热试验葛根芩连汤及葛根芩连汤药效组分解热强度为:阿司匹林(0.14g/kg)>药效组分2(0.125g/kg)>药效组分 1(0.120g/kg)>葛根芩连汤(4.320g/kg)。(2)抗炎试验①对大鼠足跖肿胀的影响 组分2(致炎后6h与致炎前的差值为0.34±0.24cm)较组分1(致炎后6h与致炎前的差值为0.35±0.44cm)有较好的抑制大鼠足趾肿胀的效果,与葛根芩连汤(致炎后6h与致炎前的差值为0.33±0.26cm)有较相似的用药效果。②对小鼠耳廓二甲苯致炎的影响 组分2(27.89%)的抑制肿胀效果要优于组分1(25.55%)组及葛根芩连汤组(26.78%)。(3)镇痛试验①热板法所致小鼠痛阈值的影响 葛根芩连汤组(给药后60min后痛阈为27.5±3.4s)具有较好的延长小鼠痛阈的效果,并且优于组分2组(给药后60min后痛阈为27.2±4.1s)及组分1组(给药后60min后痛阈为27.1±3.1s)。②对醋酸所致小鼠扭体反应的影响 组分2镇痛百分率(43.89%)优于葛根芩连汤组(42.47%)及组分1组(41.62%)。(4)免疫调节试验组分2(刚果红量为6.04±0.34μg/mL)的用药效果要优于组分1组(刚果红量为6.14±0.54μg/mL)及葛根芩连汤组(刚果红量为6.54±0.37μg/mL)。(5)胃肠运动功能试验药效组分的止泻效果要优于葛根芩连汤(胃内残留率为45.12±6.31%),其中,组分2(胃内残留率为46.01±427%)的药用效果最佳。(6)对番泻叶所致小鼠腹泻的止泻作用组分2的用药效果(腹泻指数0.62±0.10)要优于组分1(腹泻指数0.63±0.10)及葛根芩连汤(腹泻指数0.64±0.06)。3.1.2.2与主治相关的实验(1)抑菌试验药效组分2(大肠埃希菌的MIC为5mg/ml;MBC为5mg/ml,痢疾志贺杆菌的MIC为2.5 mg/ml;MBC为2.5 mg/ml)的抑菌效果最好,且药用效果优于葛根芩连汤和药效组分1(大肠埃希菌的MIC为5mg/ml;MBC为1 Omg/ml,痢疾志贺杆菌的MIC为5mg/ml;MBC 为 5mg/ml)。3.2葛根芩连汤药效组分质量评价体系研究3.2.1有效性指标研究(1)标示量根据对葛根芩连汤中14种药效组分分析,可得到葛根芩连汤中所含药效组分的标示量分别为(%):葛根素、大豆苷、大豆苷元、黄芩苷、汉黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素、盐酸小檗碱、盐酸巴马汀、盐酸药根碱、盐酸表小檗碱、盐酸黄连碱、甘草酸铵、甘草苷:1.6737±0.017、0.1533±0.004、0.0473±0.003、0.4480±0.026、0.0916±0.003、0.0123±0.003、0.0067±0.0、0.0955±0.004、0.0343±0.004、0.0438±0.001、0.0360±0.002、0.0483±0.003、0.1103±0.005、0.1580±0.004。(2)抑菌生物效价在抑制乙型溶血性链球菌上,药效组分相对于葛根芩连汤的生物效价为269.15,药效组分相对于亚胺培南的生物效价为13.65。在抑制痢疾志贺杆菌上,药效组分相对于葛根芩连汤的生物效价为128.82,药效组分相对于亚胺培南的生物效价为6.58。3.2.2安全性指标研究(1)急性毒性试验实验结果为,回归方程:Y(Probit)=-35.176+8.7396Log(D),LD50 为 10.590 g·kg-1·d-1,95%可信限为9.1296-12.330g·kg-1·d-1。(2)长期毒性试验葛根芩连汤药效组分对给药组和恢复组大鼠的长期毒性指标(体重、摄食量、摄水量、血常规指标、血液生化指标、脏器系数)均无明显影响。用药后高剂量组(药效组分日服用量35.75g)仅肝脏组织有轻微的脂肪样病变,停药20d后,高剂量组肝脏组织恢复正常,可亦未见迟发性不良反应。3.2.3稳定性指标研究葛根芩连汤药效组分加速稳定性试验表明葛根芩连汤药效组分采用棕色玻璃瓶进行密封包装,温度在40℃±2℃、相对湿度为75%±5%条件下连续贮存6个月质量较稳定。葛根芩连汤药效组分长期稳定性试验表明葛根芩连汤药效组分采用棕色玻璃瓶进行密封包装,贮存温度在25℃±2℃,相对湿度为60%±10%的条件下,连续进行贮存12个月,质量较稳定。4结论4.1葛根芩连汤药效组分研究通过本研究可知与葛根芩连汤功能主治相一致的14种药效组分为,葛根素-大豆苷-大豆苷元-黄芩苷-汉黄芩苷-黄芩素-汉黄芩素-盐酸小檗碱-盐酸巴马汀-盐酸药根碱-盐酸表小檗碱-盐酸黄连碱-甘草酸铵-甘草苷,各药效组分比例范围为249±3.0:23±0.6:7±0.6:67±3.0:14±3.0:2±0.0:1 ±0.0:14±0.6:5±0.6:7±0.6:5±0.6:7±0.6:16±0.6:23 ± 0.6。4.2葛根芩连汤药效组分质量评价体系研究4.2.1有效性指标葛根芩连汤中所含14种药效组分标示量为1.43±0.038 g。抑菌生物效价表明,在抑制乙型溶血性链球菌上,1g药效组分所产生的生物效价相当于269.15g的复方药材;在抑制痢疾志贺杆菌上,1g药效组分所产生的生物效价相当于128.82g的复方药材。4.2.2安全性指标药效组分在相当于葛根芩连汤25倍临床用量(药效组分日服用量35.75g)时,仅肝脏组织有轻微的脂肪样病变,停药20d后,肝脏组织恢复正常,亦未见迟发性不良反应。4.2.3稳定性指标葛根芩连汤药效组分采用棕色玻璃瓶密封包装,在遮光、密封、阴凉干燥条件下贮存12个月稳定性良好。4.3对葛根芩连汤药效组分质量标准的建议根据以上研究,对葛根芩连汤药效组分质量评价标准建议如下:葛根芩连汤中所含药效组分的标示量为:1.43±0.038 g;在抑制乙型溶血性链球菌上,1g药效组分相对于葛根芩连汤的生物效价为269.15,在抑制痢疾志贺杆菌上,1g药效组分相对于葛根芩连汤的生物效价为128.82;建议药效组分日服用量为0.37-1.43g,一个疗程3天;药效组分可在棕色玻璃瓶密封包装、遮光贮存,有效期暂定为2年。5创新点5.1确定了葛根芩连汤解表清里药效组分药效组分为:葛根素-大豆苷-大豆苷元-黄芩苷-汉黄芩苷-黄芩素-汉黄芩素-盐酸小檗碱-盐酸巴马汀-盐酸药根碱-盐酸表小檗碱-盐酸黄连碱-甘草酸铵-甘草苷,比例为:249±3.0:23±0.6:7±0.6:67±3.0:14±3.0:2±0.0:1±0.0:14±0.6:5±0.6:7±0.6:5±0.6:7±0.6:16±0.6:23±0.6。5.2建立了葛根芩连汤药效组分质量评价指标5.2.1有效性指标葛根芩连汤中所含药效组分的标示量为1.43±0.038 g。在抑制乙型溶血性链球菌上,1g药效组分所产生的生物效价相当于269.15g的复方药材;在抑制痢疾志贺杆菌上,1g药效组分所产生的生物效价相当于128.82g的复方药材。5.2.2安全性指标药效组分在相当于葛根芩连汤25倍临床用量时,仅肝脏组织有轻微的脂肪样病变,停药后,肝脏组织恢复正常,亦未见迟发性不良反应。5.2.3稳定性指标葛根芩连汤药效组分采用棕色玻璃瓶密封包装,在遮光、密封、阴凉干燥条件下贮存12个月稳定性良好。根据药典规定,可以暂定药效组分的有效期为2年。