P2X受体是ATP门控的细胞膜离子通道,是一种非选择性的离子通道,胞外的ATP结合后可导致通道开放,并介导Na+、K+、Ca2+等离子进入细胞。目前已鉴定并克隆得到7种不同的P2X亚型,分别为P2X1、P2X2、P2X3、P2X4、P2X5、P2X6、P2X7。P2X受体是由三个亚基组成的同源或异源三聚体,在哺乳动物细胞中广泛分布,参与了多种生理过程,包括神经系统、心血管、呼吸、胃肠以及泌尿生殖系统等几乎所有组织和器官的功能调节。这些同源或异源三聚体的紊乱与很多疾病相关,如多发性硬化、类风湿性关节炎、慢性神经痛、脑中风以及血栓形成等,是一类重要的创新药物发现的新靶标。目前已有20多个以P2X受体为靶标的小分子化合物进入到治疗类风湿性关节炎、血栓以及各类疼痛综合症等疾病的临床前或者临床Ⅱ、Ⅲ期研究阶段。随着P2X开放和关闭状态下晶体结构的解析,对于P2X的功能和新药发现的研究顺利进入晶体后研究时代,这些结构为科学家在原子水平研究各个区域的功能和其在门控过程中的构象变化、离子通道病发生的结构基础以及基于结构的创新药物发现提供了充分的结构信息。在P2X晶体结构解析出来之前,针对通道激活过程中发挥关键作用的残基/部分连续序列区域（Motif）的研究取得了一定的进展。新解析的P2X晶体结构为我们提供了重新定义这些残基/Motif功能的结构基础。R309、D85和W164（鼠源P2X4,rP2X4编号）在整个P2X家族中高度保守,R307（对应于rP2X4的R309）参与了病人P2X7受体单核苷酸多态性导致的P2X受体功能丧失介导的磷脂酶功能缺失相关的离子通道病的发生。之前的研究认为它们主要参与ATP的结合,但在解析得到的晶体结构中我们发现,这两个氨基酸距离ATP结合位点距离相对较远（最近的受体配体的原子距离大于12 A）,而且R309和D85通过相互作用形成了盐桥,显然不可能直接参与ATP的识别,所以我们需要重新定义这些氨基酸的功能。我们证明了这对盐桥在P2X受体的表达和通道激活过程中发挥重要的功能,而不是作为ATP的直接结合位点。综合运用点突变、二硫键桥接、电荷互换等手段,我们鉴定了这对盐桥是P2X受体的表达和通道激活中必不可少的结构元件。这对盐桥可能主要参与稳定与D85共价偶联的β2,3的弯折构象。βP2,3的弯折构象对于稳定头部、背鳍、右鳍和loopβ7,8区域之间的相互作用是必不可少的。使用二硫键交联的方法使β2,3沿着或者背离自身本来的方向运动导致通道获得和失去功能。在β2,3之间插入大的侧链以及改变α2的位置导致β2,3弯折结构的变化,最终导致了通道功能的丧失。这些实验数据为我们重新定义盐桥R309-D85及与其结构上相连的β2,3的功能提供了重要的依据。在研究R309-D85这对盐桥功能的过程中,通过多元动力学、最低能量路径分析以及分子动力学模拟等计算机技术,我们发现在通道关闭到开放过程存在一个中间状态,即β2,3经历了一个先向左再向右运动的中间状态,这个中间状态的存在在通道激活过程中是必不可少的。综合运用点突变、二硫键桥接、金属桥和共价修饰等手段,阻止中间状态的发生,发现P2X的功能受损或完全丧失,揭示了中间状态对于通道发挥功能至关重要。使用二硫键交联阻止Beak区域和Body区域的相对运动,通道的激动剂识别和门控过程发生改变,这些结果表明在通道门控过程中,β2,3参与的中间状态（即通道从静息状态到开放状态构象转化的路径）主要是参与协调与ATP偶联相关的各个区域之间的构象变化,协调各关键区域之间的相对运动,并导致最终通道的开放。中间状态的发现帮助我们深入了解P2X通道的门控机制,为基于P2X这种离子通道的新型药物设计提供了全新的结构信息。