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目的运用siRNA技术下调幽门螺杆菌(Helicobacter pylori,Hp)感染的AGS细胞中的ASH2L表达,研究在Hp感染的AGS细胞中ASH2L表达下调对NF-κB信号通路激活的影响,揭示ASH2L在Hp感染相关疾病中的作用,为Hp感染相关疾病的诊断与防治提供理论依据。方法运用siRNA技术下调AGS细胞中的ASH2L表达,用Hp感染AGS细胞,免疫印迹法技术检测ASH2L以及NF-κB信号通路相关蛋白分子(IκBα、H3和H3K4me3)的表达,酶联免疫吸附实验检测NF-κB靶基因(IL-8、TNF-α和IκBα)表达,以此研究ASH2L表达下调对Hp感染AGS细胞后NF-κB信号通路激活的影响。1.ASH2L-siRNA序列的设计及选择(1)ASH2L-siRNA序列的设计:按siRNA的设计原则,针对ASH2L靶序列设计3对siRNA序列和1对siRNA NC序列,分别命名为ASH2L-homo-251、ASH2L-homo-1455、ASH2L-homo-1564和siRNA-NC。(2)荧光定量PCR法(realtime fluorescence quantitative PCR)检测ASH2L-siRNA序列的沉默效果:培养AGS细胞,制备细胞悬液。用lipofectamine2000分别包裹上述3对siRNA和siRNA-NC,转染AGS细胞,建立siRNA沉默ASH2L实验组和siRNA-NC阴性对照组。转染48h后的15min收集各组细胞,提取RNA以荧光定量PCR法分别检测3对siRNA对细胞中ASH2L的沉默效果。2.ASH2L表达下调对幽门螺杆菌Hp感染AGS细胞后NF-κB信号通路激活的影响研究(1)ASH2L在AGS细胞中的表达下调:用上述siRNA技术实现ASH2L在AGS细胞中的表达下调,设立siRNA-ASH2L实验组和siRNA-NC对照组,在加入处理因素(Hp活菌悬液或细胞培养液)后的15min、45min、75min、105min收集各组上清培养液和细胞,并通过荧光定量PCR法及免疫印迹法(Western blot)检测ASH2L在AGS细胞中的沉默效果。(2)免疫印迹法检测NF-κB信号通路相关蛋白分子的表达:将收集的细胞超声破碎,进行SDS-PAGE电泳,转膜后用特异性抗体检测免疫杂交信号,检测p65、IκBα、H3和H3K4me3在各组细胞不同处理因素的各时间点的表达情况。(3)酶联免疫吸附实验(Enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)检测NF-κB靶基因的表达:检测上述方法收集的各时间点的上清培养液中IL-8和TNF-α的表达情况,同时检测各时间点的各组细胞中IκBα的表达情况。结果1.ASH2L-siRNA序列的选择及条件优化(1)转染条件优化结果:经实验发现AGS细胞生长汇合至70%进行转染,siRNA-ASH2L/lipofectamine 2000和siRNA-NC/lipofectamine 2000的比例在3:2时,转染48h后瞬时转染效率最高。(2)荧光定量PCR法检测siRNA沉默ASH2L效应的结果:将ASH2L-homo-251、ASH2L-homo-1455、ASH2L-homo-1564作为实验组,siRNA-NC作为对照组进行实验,发现ASH2L-homo-251下调ASH2L表达下调效果优于ASH2L-homo-1455和ASH2L-homo-1564,故选用ASH2L-homo-251作为siRNA-ASH2L实验组,siRNA-NC作为对照组来进行后续实验。2.ASH2L表达下调对Hp感染AGS细胞后NF-κB信号通路激活影响的研究结果(1)siRNA-ASH2L在感染和未感染Hp的AGS细胞中沉默ASH2L效果的检测结果荧光定量PCR检测结果:以ASH2L-homo-251作为siRNA-ASH2L实验组,siRNA-NC为对照组,分别研究在Hp感染和Hp未感染的条件下AHS2L的表达下调情况。在未感染Hp的siRNA-ASH2L实验组中AGS细胞的ASH2L在各时间点的表达量均低于siRNA-NC对照组各时间点的表达量,差异有统计学意义;在Hp感染的siRNA-ASH2L实验组中AGS细胞的ASH2L在各时间点的表达量均低于对应时间点siRNA-NC对照组,差异有统计学意义。表明在Hp感染和未感染的条件下,通过siRNA技术均可实现ASH2L在AGS细胞中的表达下调。Western blot检测ASH2L在不同处理因素的siRNA-ASH2L实验组和siRNA-NC对照组细胞中的表达:在未感染Hp的AGS细胞中,ASH2L在siRNA-ASH2L实验组各时间点的表达量显著低于siRNA-NC对照组,差异有统计学意义;在感染Hp的细胞中,ASH2L在实验组各时间点的表达量显著低于siRNA-NC对照组,差异有统计学意义。表明在感染和未感染Hp的AGS细胞中均实现了ASH2L的表达下调。同时发现感染Hp的对照组ASH2L在各时间点的表达量均显著高于未感染Hp的对照组和未感染Hp的siRNA-ASH2L实验组,差异有统计学意义。(2)Western blot检测NF-κB信号通路相关蛋白分子的表达结果p65的表达情况:p65在未感染HP的siRNA-ASH2L实验组各时间点表达量低于siRNA-NC对照组,差异有统计学意义。在感染Hp的细胞中,p65在siRNA-ASH2L实验组各时间点的表达量均显著低于对应时间点的siRNA-NC对照组细胞,差异有统计学意义。感染Hp对照组细胞中的p65在各时间点的表达量均显著高于未感染Hp的对照组细胞和未感染Hp的siRNA-ASH2L实验组,差异有统计学意义。IκBα的表达情况:IκBα在未感染Hp的siRNA-ASH2L实验组各时间点表达量均低于siRNA-NC对照组,差异有统计学意义。在感染Hp的细胞中,IκBα在siRNA-ASH2L实验组各时间点的表达量均显著低于对应时间点的siRNA-NC对照组细胞,差异有统计学意义。感染Hp对照组细胞中的IκBα在各时间点的表达量均显著高于未感染Hp的对照组细胞和未感染Hp的siRNA-ASH2L实验组,差异有统计学意义。H3的表达情况:H3在未感染Hp的siRNA-ASH2L实验组各时间点表达量均低于siRNA-NC对照组,差异有统计学意义。在感染Hp的细胞中,H3在siRNA-ASH2L实验组各时间点的表达量均显著低于对应时间点的siRNA-NC对照组细胞,差异有统计学意义。感染Hp对照组细胞中的H3在各时间点的表达量显著高于未感染Hp的对照组细胞和未感染Hp的siRNA-ASH2L实验组,差异有统计学意义。H3K4me3的表达情况:H3K4me3在未感染Hp的siRNA-ASH2L实验组各时间点表达量均低于siRNA-NC对照组,差异有统计学意义。在感染Hp的细胞中,H3K4me3在siRNA-ASH2L实验组各时间点的表达量均显著低于对应时间点的siRNA-NC对照组细胞,差异有统计学意义。感染Hp对照组细胞中的H3K4me3在各时间点的表达量均显著高于未感染Hp的对照组细胞和未感染Hp的siRNA-ASH2L实验组,差异有统计学意义。(3)同ELISA检测NF-kB靶基因表达的结果IL-8的检测结果:在未感染Hp的siRNA-ASH2L实验组细胞中IL-8在各时间点的表达量略低于对应时间点未感染Hp的siRNA-NC对照组细胞,差异无统计学意义。在Hp感染的细胞中,IL-8在siRNA-ASH2L实验组细胞的各时间点的表达量均低于对应时间点的siRNA-NC对照组细胞,差异有统计学意义。感染Hp对照组细胞中的IL-8在各时间点的表达量显著高于未感染Hp的对照组细胞和未感染Hp的siRNA-ASH2L实验组。TNF-α的检测结果:在未感染Hp的siRNA-ASH2L实验组细胞中TNF-α在各时间点的表达量略低于对应时间点未感染Hp的siRNA-NC对照组细胞,差异无统计学意义。在Hp感染的细胞中,TNF-α在siRNA-ASH2L实验组细胞的各时间点的表达量均低于对应时间点的siRNA-NC对照组细胞,差异有统计学意义。感染Hp对照组细胞中的TNF-α在各时间点的表达量均显著高于未感染Hp的对照组细胞和未感染Hp的siRNA-ASH2L实验组。IκBα的检测结果:在未感染Hp的siRNA-ASH2L实验组细胞中IκBα在各时间点的表达量显著低于对应时间点未感染Hp的siRNA-NC对照组细胞,差异有统计学意义。在Hp感染的细胞中,IκBα在siRNA-ASH2L实验组细胞的各时间点的表达量均低于对应时间点的siRNA-NC对照组细胞,差异有统计学意义。感染Hp对照组细胞中的IκBα在各时间点的表达量显著高于未感染Hp的对照组细胞和未感染Hp的siRNA-ASH2L实验组。结论1.设计的ASH2L-siRNA序列通过lipofectamine 2000转染,可在AGS细胞中实现ASH2L表达的下调。2.对照组中随Hp感染AGS细胞时间的延长,ASH2L表达量增高,表明Hp感染可导致上调ASH2L表达,进而激活NF-κB信号通路。3.在感染Hp对照组细胞中的NF-κB信号通路相关蛋白分子(P65、IκBα、H3、H3K4me3)在各时间点的表达量显著高于未感染Hp的对照组细胞及未感染Hp的实验组细胞,表明感染Hp可导致AGS细胞NF-κB信号通路的激活;而这些NF-κB信号通路相关蛋白分子在感染Hp的siRNA-ASH2L实验组细胞中各时间点的表达量均显著低于对应时间点的感染Hp的siRNA-NC对照组细胞,说明下调ASH2L表达可使Hp感染后的NF-κB信号通路的激活度下降。4.感染Hp的对照组细胞中NF-κB靶基因(IL-8、TNF-α、IκBα)的表达量随感染时间的延长而增加,表明Hp的感染可增加NF-kB靶基因的表达量;而这些靶基因在感染Hp的siRNA-ASH2L实验组细胞中各时间点的表达量均显著低于对应时间点的感染Hp的siRNA-NC对照组细胞,表明下调ASH2L表达可使Hp感染后的NF-κB相关靶基因IL8、TNF-α、IκBα的表达下调。5.本研究初步表明下调ASH2L表达可使Hp感染后的NF-κB信号通路的激活度下降,同时下调NF-κB相关靶基因IL-8、TNF-α、IκBα的表达。