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纳米抗体及干扰素等蛋白药物的研制为预防和治疗禽流感(Avian Influenza,AI)提供了新的途径。纳米抗体(Nanobody,又被称为VHH)是Camelidae重链抗体的可变区,该可变区与抗原有较高的亲和力。本研究的第一部分为抗禽流感M2蛋白的纳米抗体的研制。纯化获得用于禽流感噬菌体展示库粗筛的可溶性禽流感TRX-M2蛋白及用于筛选后ELISA检测的GST-M2蛋白后,完成了抗禽流感病毒(Avian Influenza Virus,AIV)噬菌体展示库的粗筛,并分析了阳性纳米抗体克隆与禽流感M2蛋白的亲和力。经过固相.液相轮换淘选后,噬菌体展示库的回收率达到10-2。通过Phage-ELISA筛选到M215、M218、M221和M24四株阳性克隆。氨基酸序列分析表明该四株阳性纳米抗体克隆的37位氨基酸为Phe或Tyr,44位氨基酸为Gin或Glu,45位氨基酸为Arg,其CDR3区变化呈多样性。M215和M218纳米抗体经E coli BL21(DE3)原核包涵体表达后,再经Ni-NTA柱层析纯化,进而复性获得复性纳米抗体蛋白。SDS-PAGE和Western检测进一步证明该复性蛋白大小与预期相符。ELISA结果表明M218与M2蛋白的亲和力高于M215与M2蛋白的亲和力。而后,本研究讨论了复性重组M215和M218蛋白作为AIV诊断试剂和治疗药物的可能性。
禽源Ⅰ型干扰素具有显著的抗病毒作用。本研究第二部分比较了禽源Ⅰ型干扰素Chicken interferon-α(ChIFN-α)和interferon-β(ChIFN-β)抗病毒活性,初步探讨了ChIFN-α和ChIFN-β抗病毒活性差异的机理;通过SPF鸡实验证明了口服ChIFN-a能预防和治疗H9N2 AIV。研究表明,ChIFN-α抗VSV的活性比ChIFN-β的相应活性高1000倍,ChIFN-α抗AIV活性和抗NDV活性均比ChIFN-β的相应活性高100倍。用相同活性单位的ChIFN-α和ChIFN-β重组蛋白处理等量DF-1细胞后,采用real-time PCR方法检测了DF-1细胞中8种干扰素调节基因(2’,5’-OAS、PKR、IFNAR1、IFNAR2、IL-6、IL-8、ChIFN-α和ChIFN-β)的mRNA水平变化。与重组CMFN-B蛋白处理组相比,重组ChIFN-α蛋白能有效诱导所检测的除IL-8基因以外的其余7种干扰素调节基因的产生,从而部分解释了ChIFN-α和ChIFN-β的抗病毒活性差异。
ChIFN-α是鸡体内重要的抗病毒细胞因子,本研究通过7日龄和33日龄SPF鸡动物实验证明口服ChIGN-α能抑制H9N2 AIV在鸡体内的增殖。通过real-timePCR方法测定鸡体气管中的H9N2病毒载量后发现,对7日龄SPF鸡而言,ChIFN-α对H9N2AIV感染的治疗效果优于预防效果,而在33日龄SPF鸡体内的预防效果则优于治疗效果,这可能是由于33日龄SPF鸡的免疫系统比7日龄SPF鸡的更成熟所造成的。7日龄和33日龄SPF鸡体重变化结果表明,口服ChIFN-α对SPF鸡体重增长无副作用。口服ChIFN-α或(和)病毒感染后,2’,5’-OAS和Mx1的mRNA水平均升高,表明这两种ISGs(interferon stimulatedgenes)不仅参与鸡体的抗病毒应答,而且也能被外源ChIFN-α所诱导。因此,重组ChIFN-α蛋白可作为一种预防和治疗H9N2禽流感病毒感染的口服制剂。