软X射线三维纳米断层成像技术在生物学、医学、材料科学等领域有着广泛的应用。细胞中的水对水窗波段的软X射线吸收弱,而有机物中的碳、氮等元素对其的吸收强,所以有机物在软X射线成像中具有较高的吸收衬度。因此仅需快速冷冻细胞,即可对其进行软X射线显微成像,得到完整的亚细胞结构。因此软X射线显微镜非常适合对含水细胞成像。软X射线断层成像技术通过采集多角度的吸收衬度投影图像,利用图像重建技术,重建得到细胞的三维结构图像,可以观测细胞的亚细胞结构。但是在现有软X射线成像的分辨率下,细胞中执行功能的特定分子无法直接通过软X射线断层成像技术定位。然而这些分子可以被荧光团特异性标记,通过荧光显微镜定位,以获得被标记分子的信息。但荧光显微成像无法得到细胞整体结构以及内部亚细胞结构的信息。联合软X射线显微镜和荧光显微镜,可以观察到同一个细胞的三维结构和其中特定分子的位置,在细胞的三维结构中定位特定分子,获得细胞结构和功能的关系。因此,软X射线与荧光联合显微成像技术是研究细胞结构与功能关系的重要技术手段。本论文发展了软X射线显微镜和荧光显微镜的联合成像实验技术以及两种显微图像的匹配方法,开发了用于数据处理的软件。本文根据软X射线显微镜与荧光显微镜联合成像的特点、研究进展及存在的问题,同时结合合肥光源软X射线成像实验站的实验条件,开展了以下的工作:1.介绍了软X射线显微镜成像技术,并总结了其应用范围及成果。综述了软X射线显微镜和荧光显微镜的联合成像技术特点,介绍了各种基于软X射线显微镜的联合成像技术、其图像匹配的方法、所应用的领域及需解决的问题。2.根据合肥光源软X射线实验站的情况,介绍了软X射线显微镜的基本原理、样品制备、实验操作及数据处理等。发展了软X射线图像和荧光图像基于基准点的高精度匹配方法和计算程序。通过该方法,准确匹配了软X射线图像和荧光图像,获得了软X射线和荧光的融合图像,实现了软X射线显微镜和荧光显微镜的联合成像。据此在细胞的三维断层数据中定位了液泡及线粒体等细胞器,初步解决了细胞荧光图像与软X射线图像的三维图像融合问题,验证了软X射线断层成像计算的细胞器线性吸收系数对细胞器鉴定的准确性。3.针对宽场荧光显微镜分辨率较低的问题,建设了基于单分子定位的基态耗尽继单分子回返超分辨荧光显微镜（ground state depletion microscopy followed by individual molecule return,GSDIM）,大大提高 了联合成像中荧光显微镜的分辨率。基于宽场荧光显微镜建设了适用于GSDIM的照明系统,改建了成像系统和样品台,完成了 GSDIM超分辨荧光显微镜;同时,发展了 GSDIM超分辨成像的数据重建方法及相关流程。最终,成功获得了肌动蛋白细丝的超分辨荧光图像,基于获得的荧光图像,测得超分辨荧光显微镜的分辨率为30～40纳米,可实现对细胞的高分辨率荧光成像。4.发展了软X射线显微镜和GSDIM超分辨荧光显微镜的联合成像技术,及其数据处理软件;其成像深度可达4.5微米,在联合成像中成功实现了大成像深度内对亚细胞结构的高分辨率荧光定位。利用此技术,成功融合了软X射线图像与超分辨荧光图像,通过融合图像精确定位识别了细胞中的线粒体,溶酶体等细胞器,为细胞功能成像与结构成像的结合奠定了基础。发展的软X射线显微镜和GSDIM超分辨荧光显微镜的联合成像技术已对用户开放。