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西藏灵菇(Tibetan Kefir),又称雪莲菌、藏灵菇,类似于kefir粒,源自西藏高原的特有珍稀菌种,是我国独有的世界珍宝。西藏灵菇是由酵母菌、乳酸菌和醋酸菌等微生物在多糖的环境中,经过长期相互适应与协同作用形成的非常复杂的多菌种共生体系,通常以颗粒状存在(本文中简称为菌粒)。大量实践与研究证明,西藏灵菇发酵乳具有提高人体免疫力、抗癌、防癌等多种功效,推测多糖是其中的主要活性成分,但目前对西藏灵菇多糖的活性与理化性质的研究甚少;此外,西藏灵菇菌粒的微生物菌群构成复杂,且具有明显的地域差异性,导致发酵过程中产品品质难以控制。因此,有必要掌握其中的微生物构成与特性,明确其内在作用机制,从而为该产品的发酵控制与质量保证提供理论依据。本研究针对上述问题进行了较为系统的研究,得到以下结论:(1)西藏灵菇多糖的基本特性与抗氧化活性。通过醇沉、去蛋白、再次醇沉等过程,对西藏灵菇发酵乳中的多糖进行分离纯化;对该多糖进行傅立叶红外光谱分析和单糖组成分析,发现其不含有糖醛酸,单糖组成为葡萄糖和半乳糖,两者的摩尔比为1:1.88;经扫描电子显微镜分析,发现该多糖的表面粗糙,呈颗粒状,结构致密;经差示扫描量热仪检测发现,该多糖的熔点较高(131.46℃),热焓为209.6 J/g,具有良好的热稳定性;体外抗氧化活性分析表明,该多糖能够有效地清除DPPH和ABTS自由基,还原Fe3+离子,对AAPH和Cu2+/H2O2诱导的蛋白损伤具有较强的保护能力。(2)西藏灵菇多糖的流变学特性与乳化性质。用流变仪检测西藏灵菇多糖水溶液的流变学特性,考察多糖浓度、体系pH、温度、盐离子种类和浓度对其流变学特性的影响,结果发现:该多糖水溶液表现为典型的非牛顿假塑性流体特征,表观黏度随着多糖浓度的增大而增加,具有增稠性;10 mg/m L的多糖水溶液在10~85℃的范围内,表观黏度无明显变化,耐热性强;-20℃冷冻处理后多糖溶液的表观黏度明显增加,表现出良好的冻融稳定性;pH由7.0变为4.0或10.0时,多糖溶液的表观黏度显著下降,表现为酸性和碱性不稳定;加入Na+可显著增加多糖溶液的表观黏度,且为Na+浓度依赖性;加入Ca2+可显著降低其表观黏度,且与Ca2+浓度无关。该多糖对植物油水溶液的乳化活性与乳化稳定性随多糖浓度的增大而增强,且其作用效果不受pH和NaCl的影响。(3)西藏灵菇多糖的组分分析与结构解析。将纯化后的西藏灵菇多糖经DEAE-Sepharose Fast Flow阴离子交换柱分离,可得一个水洗脱组分(TKEP1)和两个NaCl洗脱组分(TKEP2,0.25 mol/L NaCl;TKEP3,0.5 mol/L NaCl);用Sephadex G-100凝胶柱对TKEP1组分继续分离,可得三个水洗脱组分,TKEP1-A、TKEP1-B、TKEP1-C,其中前两者含有少量蛋白质,只有TKEP1-C为不含蛋白质的中性多糖。进一步分析表明,TKEP1-C的糖含量为98.7%(苯酚-硫酸法),分子量为2.065×103 Da(高效凝胶渗透色谱法),单糖组成为葡萄糖:半乳糖=1.17:1(气相色谱法),含有β-糖苷键和α-糖苷键(傅立叶红外图谱法);甲基化分析可知,该组分为线性杂多糖,葡萄糖主要以1,4和1,6糖苷键的形式存在,半乳糖主要以1,4、1,3和1,6糖苷键形式存在,其中1,4-葡萄糖(31.03%)和1,6-半乳糖(23.08%)所占比例较大,葡萄糖形成主链的非还原末端。(4)西藏灵菇中多糖产生菌及其多糖的基本特性与活性。分别用乳酸菌、醋酸菌和酵母菌鉴别培养基对西藏灵菇菌粒与发酵乳中的微生物菌种进行分离纯化,共获得15个微生物菌种;经分子生物学鉴定,其中3株为假肠膜明串珠菌(Leuconostoc pseudomesenteroides),2株为乳酸乳球菌乳酸亚种(Lactococcus lactis subsp.Lactis),4株为冲绳醋酸菌(Acetobacter Okinawensis),1株为酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae),5株为单胞酿酒酵母(Kazachstania unispora);分别检测每株菌产多糖的能力,发现所得菌株中只有6株能在发酵乳中产生多糖,分别为RJ-1、RJ-2和RJ-5(假肠膜明串珠菌)、RJ-4(冲绳醋酸菌),以及JM-5和JM-7(单胞酿酒酵母);对每株菌在发酵乳中所产多糖的单糖组成和表面微观结构分析发现,每种菌在脱脂乳中单独培养时所产多糖与西藏灵菇多糖在这些特性上均不相同,但是,单菌多糖对AAPH诱导的蛋白损伤也具有一定程度的保护作用,其中JM-5产多糖的保护作用最强,与西藏灵菇多糖相近。(5)西藏灵菇菌粒形成的微生物基础。从微生物菌种的聚集能力、菌膜形成、菌种互作几个方面探究西藏灵菇菌粒的形成机制。研究发现,JM-7和RJ-4的自聚集能力最强,RJ-5的菌膜形成能力最强,推测其在西藏灵菇菌粒形成的过程中起到重要作用;将分离得到的15株菌所得的活性干粉等比例接种到脱脂乳中,在不断转接过程中可形成形状不规则的粒状物,其表面微观形态及菌种分布与西藏灵菇菌粒相似,所得发酵乳中多糖的单糖组成与西藏灵菇多糖相同;且其发酵乳的主体挥发性成分与西藏灵菇发酵乳相似,具有西藏灵菇发酵乳的独特风味。