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背景与目的:心肌缺血/再灌注(Ischemia/Reperfusion,I/R)损伤是指心肌组织缺血后再复灌不仅不能改善心肌组织的功能反而加重其损伤的过程。近年来,随着人们生活习惯的改变,冠心病的患病率越来越高。心肌缺血/再灌注损伤是冠心病治疗过程中的常见病症,并对冠心病的治疗效果和预后有重要影响。因此,如何预防和治疗I/R损伤是心血管疾病研究领域的热点之一。研究表明,F-box家族蛋白成员FBXO25(F-box protein-25)可与Skp1、Cullin1、Roc1连接形成SCF(Skp1-Cullin1-F-box protein)E3连接酶复合物而发挥泛素连接酶作用,进而降解相关底物蛋白。本文利用大鼠心肌细胞H9C2进行缺氧/复氧(hypoxia/reoxygenation,H/R)处理来复制心肌缺血/再灌注损伤模型,研究FBXO25蛋白在心肌缺血/再灌注损伤中的作用及其机制,以期为寻找治疗心肌缺血/再灌注损伤的新的靶点提供实验依据。方法:1.小鼠FBXO25表达的检测:取成年小鼠多种组织器官,用RT-PCR和Western blot分别在mRNA水平和蛋白水平检测FBXO25在各器官的表达情况;2.心肌细胞缺氧/复氧损伤模型的制备:利用厌氧培养箱建立H9C2缺氧/复氧(H/R)损伤模型,首先将H9C2细胞置于缺氧培养液中2h、4h、6h、8h、10h和12h,并以正常培养液处理心肌细胞为对照,Western blot检测FBXO25蛋白的表达情况,并以FBXO25蛋白变化较大的缺氧时间作为基本缺氧处理,然后将细胞置于复氧培养液中0h、3h、6h、9h、12h和24h,Western blot检测FBXO25蛋白的表达情况;3.过表达或敲减FBXO25基因的心肌细胞制备:利用基因工程技术构建FBXO25过表达质粒pEGFP-C1-FBXO25和FBXO25干扰质粒sh RNA-FBXO25,然后将质粒分别转染到H9C2细胞中。实验分组为:(1)正常对照组(NC);(2)缺氧/复氧组(H/R);(3)空载质粒缺氧/复氧组(p EGFP-C1 2μg+H/R);(4)FBXO25过表达I组(p EGFP-C1-FBXO25 1μg+H/R);(5)FBXO25过表达II组(p EGFP-C1-FBXO25 2μg+H/R);(6)FBXO25敲减组(sh RNA-FBXO25 2μg+H/R)。用Western blot检测FBXO25蛋白的表达情况,MTT和乳酸脱氢酶(LDH)分别检测细胞存活率和损伤程度。4.机制分析:利用Western blot检测活性氧(reactive oxygen species,ROS)相关蛋白NADPH氧化酶2(NOX2)、NADPH氧化酶4(NOX4)、锰超氧化物歧化酶(SOD2)和过氧化氢酶(CAT)蛋白的表达水平。结果:1.在小鼠心、肝、脾、肺、肾、脑和骨骼肌等组织中都能检测到FBXO25基因的mRNA及蛋白表达,但FBXO25在心脏和骨骼肌中的表达水平较低。2.缺氧/复氧明显增加心肌细胞H9C2的损伤和死亡率,并显著降低心肌细胞的FBXO25表达水平。3.过表达FBXO25基因明显减轻缺氧/复氧诱导的心肌细胞损伤和死亡率,而敲减该基因则显著加重心肌细胞的缺氧/复氧损伤和死亡率,且成剂量依赖性。4.缺氧/复氧条件下,过表达FBXO25基因能明显减少NOX4蛋白的表达,增加CAT和SOD2蛋白的表达。结论:本研究发现,缺氧/复氧能明显诱导心肌细胞损伤和死亡,并降低心肌细胞FBXO25蛋白的表达;过表达FBXO25能明显降低缺氧/复氧诱导的心肌细胞损伤和死亡率,敲减FBXO25则可增加缺氧/复氧诱导的心肌细胞损伤和死亡率;且过表达FBXO25基因能明显减少NOX4蛋白的表达,增加CAT和SOD2蛋白的表达。以上结果表明,FBXO25蛋白可能是一个有效的对缺氧/复氧损伤具有保护作用的内源性心肌保护因子,且可能是通过减少氧自由基的产生和上调抗氧化酶的活性来发挥这种保护作用。