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第一部分带有穿膜肽重组PTD-Oct4-6His的制备及活性鉴定目的基因重组构建具有穿膜活性转录因子PTD-Oct4-6His蛋白的原核表达系统。方法利用重叠延伸PCR法重组目的基因构建质粒PKYB-PTD-Oct4,并转化至Ecoil ER2566。镍柱层析纯化重组蛋白并用Western bloting鉴定。用异硫氰酸荧光素(fluorescein isothiocyanate, FITC)标记PTD-Oct4检测其穿透中国仓鼠卵巢(chinese hamster ovary, CHO)细胞细胞膜的能力；用荧光共振能量转移(fluorescence resonance energy transfer, FRET)检测重组融合蛋白PTD-Oct4结合目的DNA的活性。结果成功获得目的蛋白PTD-Oct4,其可以成功进入细胞、定位细胞核内,穿膜效率为28.3±2.4%,并具有与目标DNA序列特异结合的能力。结论本研究为制备重组PTD-Oct4并将其作为外源蛋白诱导靶细胞为多能干细胞(induced pluripotent stem cells, IPSCs)奠定基础。第二部分小鼠角膜基质细胞的原代培养目的改良小鼠角膜基质细胞分离培养方法,为角膜基质细胞生物学、利用小鼠角膜基质细胞诱导转化为IPS细胞、角膜组织工程等研究提供更好的种子细胞。方法采用Dispase酶消化法+组织块法分离培养原代小鼠角膜基质细胞,倒置显微镜下观察细胞生长情况,通过间接免疫荧光细胞化学染色Vimentin表型和RT-PCR检测Vimentin、Lumican和CK12基因表达对培养的细胞进行鉴别。结果倒置显微镜下可见小鼠角膜基质细胞呈三角形和树枝状,细胞间连接明显,可形成网状连接；免疫荧光组织化学鉴定小鼠角膜基质细胞表达Vimentin阳性；RT-PCR显示Vimentin和Lumican基因表达阳性,CK12表达阴性。结论Dispase酶消化法+组织块法为体外获得单纯小鼠角膜基质细胞提供了简单高效的途径。第三部分基因重组构建真核Sox2、Oct4、Klf4、c-Myc表达系统及其在小鼠角膜基质细胞中的表达目的基因重组构建具有穿膜活性的核转录因子Sox2、Oct4、Klf4、c-Myc的真核表达系统,将其转染至小鼠角膜基质细胞,检测其在小鼠角膜角质细胞中的表达。方法利用重叠延伸PCR法重组目的基因构建质粒,测序检测重组DNA序列是否克隆正确。确定正确序列后将其转染至小鼠角膜基质细胞。倒置显微镜下观察细胞生长情况,转染后第10d免疫组织化学鉴定其表达。结果成功构建质粒PCDNA3.1-Sox2、PCDNA3.1-Oct4、PCDNA3.1-Klf4、PCDNA3.1-c-Myc;测序结果显示对应基因序列正确,可成功转染至小鼠角膜基质细胞中；引起细胞形态变化,荧光免疫组织化学染色检测转染后第10d其在小鼠角膜基质中表达。结论成功构建4个核转录因子的真核表达系统,可转染至小鼠角膜基质细胞及引起细胞形态和表型的变化,本研究为真核重组外源蛋白诱导角膜基质诱导转化为IPS细胞奠定基础。