论文部分内容阅读
研究背景：绵羊肺腺瘤(Ovine pulmonary adenomatosis, OPA)是由绵羊肺腺瘤病毒(Jaagsiekte sheep retrovirus, JSRV)引起的一种传染性肺脏肿瘤性疾病。JSRV为p反转录病毒属成员,其env基因主要编码囊膜蛋白(JSRV-Env),包括表面蛋白(SU)和穿膜蛋白(TM)两个亚基。有研究表明,绵羊透明质酸酶2(hyaluronidase2, Hyal-2)在绵羊体内作为内、外源性JSRV细胞受体起作用。但有关绵羊Hyal-2与JSRV-Env及其亚基之间相互作用的研究资料尚比较缺乏。研究目的：绵羊Hyal-2作为JSRV进入绵羊机体细胞的受体起作用,因此,深入研究绵羊Hyal-2与JSRV-Env及其亚基(SU、TM)之间的相互作用,对于揭不JSRV侵染细胞及致瘤机理具有重要意义。研究方法：(1)运用重叠PCR方法扩增绵羊透明质酸酶2基因(hyal-2),并运用生物信息学软件对其表达蛋白结构进行预测。(2)构建绵羊透明质酸酶2(Hyal-2)的真核表达载体,为后期建立相关稳定表达细胞系及进行病毒感染性试验提供实验平台。(3)构建JSRV-Env及其亚基(SU、TM)真核表达载体,通过瞬时转染及测序验证真核表达载体的构建是否成功；通过激光共聚焦方法观察细胞内蛋白之间的共定位情况；用免疫共沉淀法及双分子荧光互补系统对受体与Env结合亚基进行验证。(4)运用重叠PCR方法扩增缺失型su基因,然后构建一系列表达缺失型SU蛋白的真核表达载体,通过瞬时转染及测序验证真核表达载体的构建是否成功；通过激光共聚焦方法观察细胞内蛋白之间的共定位情况：运用免疫共沉淀法及双分子荧光互补系统对Hyal2与SU亚基可能结合区域进行预测,为进一步揭示JSRV致瘤机制奠定基础。(5)用荧光定量PCR方法检测在小鼠NIH3T3细胞中单独转染pEGFP-Cl-(env、su、tm)载体后pik3ca基因和ras基因表达量的变化；用荧光定量PCR方法检测在小鼠NIH3T3细胞中分别共转染pEGFP-Cl-(env、su、tm)载体和pDsRed-monomer-N1-hyal2载体后pik3ca基因和ras基因表达量的变化。研究结果：(1)运用重叠PCR方法成功扩增出hyal-2基因,并对其结构进行了预测。(2)成功构建了携带红色荧光蛋白报告基因的表达绵羊Hyal-2蛋白的真核表达载体。(3)运用免疫共沉淀法和双分子荧光互补系统验证了Hyal-2蛋白与Env及SU亚基蛋白的结合；运用激光共聚焦显微镜确定了Env和SU与Hyal-2蛋白之间存在共定位情况,TM与Hyal-2蛋白之间不存在共定位。(4)成功构建了一系列缺失型PEGFP-C1-(sul-su5)真核表达载体,并与pDsRed-monomer-N1-hyal-2共转染,实现其在真核细胞中与Hyal-2蛋白的共表达。运用激光共聚焦方法确定了缺失型SU.蛋白蛋白与Hyal-2蛋白之间存在共定位情况；免疫共沉淀方法及双分子荧光互补系统对受体与SU蛋白可能结合区域进行了预测,结果表明SU1-SU5缺失型蛋白均不与绵羊Hyal-2蛋白结合,证明SU1-SU5蛋白所缺失的区域对于绵羊Hyal-2蛋白与Env的结合及相互作用都是非常重要的。这为进一步确定绵羊Hyal-2蛋白与SU蛋白结合位点奠定了基础。(5)荧光定量PCR方法检测在小鼠NIH3T3细胞中单独转染pEGFP-Cl-(env、 su、tm)后,pik3ca基因和ras基因表达量与对照组相比显著升高。分别共转染pEGFP-Cl-(env、su、tm)和pDsRed-monomer-N1-hyal2后,pik3ca基因和ras基因表达量与对照组相比显著降低。研究结论：(1)扩增出绵羊hyal2基因并对Hyal-2蛋白结构进行了预测,成功构建了Hyal2真核表达载体且在293T细胞中获得表达,Hyal2是分子质量为54.190kD的一种亲水性蛋白。(2)构建了JSRV-Env及其亚基SU、TM的真核表达载体并实现其在293T细胞中的表达。(3)用构建的pEGFP-Cl-(env、su、tm)真核表达表达载体与hyal-2真核表达载体pDsRed-monomer-N1-hyal2共转染293T细胞,实现其在293T细胞内的共表达,证实Env、SU与Hyal2存在相互作用,TM与Hyal2未发生相互作用。(4)缺失型sul-suS基因表达产物影响与Hyal-2蛋白的结合,其中su基因的238bp-867bp域对这种结合是必须的。(5)分别转染构建的pEGFP Cl-(env、su、tm)真核表达载体的NIH3T3细胞中,pik3ca和ras基因表达量显著升高；而共转染构建的pEGFPC1-(env、su、tm)和pDsRed-monomer-N1-hyal-2真核表达载体的NIH3T3细胞中, pik3ca和ras基因表达量显著降低。