嗜热厌氧乙醇杆菌Thermoanaerobacter ethanolicus JW200α-葡萄糖苷酶的研究

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低聚异麦芽糖(IMO)是指葡萄糖残基之间至少有一个以α-(1,6)糖苷键结合而成,单糖数在2~6之间的一类低聚糖,包括异麦芽糖,异麦芽三糖,异麦芽四糖和潘糖。功能性低聚糖异麦芽糖作为双歧杆菌增殖因子在食品工业得到了广泛的应用。α-葡萄糖苷酶是一类能切开低聚糖类底物非还原性末端的α-1,4糖苷键,释放出葡萄糖,或以α-1,6糖苷键将游离出来的葡萄糖残基转移至另一个底物上,获得非发酵性的低聚异麦芽糖(IMO)、糖脂或糖肽等的外切酶。另外在淀粉加工工业中,α-葡萄糖苷酶可作为糖化酶制剂与α-淀粉酶一起生产高葡萄糖浆。因此α-葡萄糖苷酶是生产高葡萄糖浆和低聚异麦芽糖的关键酶制剂而备受国内外食品工业界的重视。通过PCR方法从嗜热厌氧乙醇杆菌(Thermoanaerobacter ethanolicus)JW200中扩增出编码α-葡萄糖苷酶的基因,该序列已上传至GenBank数据库,基因序列号为EF635970。基因序列长度为2259bp,距离起始密码子TTG上游7bp处,推测出核糖体结合位点5’-GGAGG-3’,终止密码子为TAA。该酶的氨基酸序列同T. ethanolicus39E and T.ethanolicus X514的同源性为92%,该基因编码的α-葡萄糖苷酶属于糖基水解酶的第31家族。将其克隆到大肠杆菌(Escherichia coli)表达载体pTrc99A和热激表达载体pHsh上,获得表达α-葡萄糖苷酶的大肠杆菌重组菌。诱导表达后,SDS-PAGE检测出重组酶相对分子量约为89KDa。经过阴离子交换层析、硫酸铵盐析和分子筛层析纯化后的α-葡萄糖苷酶最适反应温度为70℃,最适反应pH为5~5.5,且pH在5.5~6.5之间稳定性较高。在70℃,pH为5.5反应条件下,以pNPG为底物测定该重组酶的Km为1.72mmol/L,最大反应速率Vmax为38.87U/mg。重组α-葡萄糖苷酶具有较强的转糖苷活性,以麦芽糖作为底物时,转糖苷产物为异麦芽糖,麦芽三糖,潘糖,异麦芽三糖和四糖。以40%麦芽糖为底物时,麦芽糖的转化率达到52%,其中异麦芽糖、潘糖和异麦芽三糖占总的转糖苷产物的83%。
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