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Wilson病(WD)是一种好发于青少年期的常染色体隐性遗传铜代谢障碍性疾病,由于ATB7B基因突变引起体内铜的代谢障碍,导致过量的铜在肝脏、脑和角膜等组织器官中异常沉积,WD患者出现肝损害症状、神经/精神症状及角膜K-F环等临床表现,严重者可危及生命。WD的病因病机研究表明,肝脏既是WD的原始缺陷部位,也是最主要的受累器官。众多临床资料研究显示,几乎所有的WD患者都可出现不同程度的肝损害症状,包括急慢性肝炎、肝硬化甚至急性(亚急性)肝坏死,而后者是WD患者主要死亡原因之一。因此,对各种肝损害的治疗是WD临床诊疗过程中的主要任务之一。上世纪70年代以来,本课题单位以中药复方肝豆汤治疗WD患者获得良好治疗效果。前期研究表明,肝豆汤可通过促进铜代谢相关蛋白的表达增加肝细胞内铜的利用并促进铜的排出,从调控铜代谢的角度初步阐释其治疗WD肝损害的疗效机制,但其对WD肝损害的疗效机制尚需进一步研究。近来研究表明,Wnt/β-catenin信号通路在肝细胞的生长、发育和代谢等方面发挥重要作用,参与各种肝脏疾病的进程,提示该通路是控制和影响肝细胞功能的关键因素之一,其异常激活与肝脏的各种病理改变密切相关。本课题组的前期研究发现高铜可使肝细胞Wnt/β-catenin活性受到抑制,加重高铜诱导的氧化应激损伤。基于此,本研究以前期建立的铜负荷大鼠WD模型为研究对象,通过观察肝豆汤治疗铜负荷大鼠前后肝脏内Wnt/β-catenin通路相关蛋白表达水平的改变,进一步探讨肝豆汤对WD肝损伤的疗效机制,为寻找治疗WD肝损伤的分子靶点提供理论依据。研究目的:探讨肝豆汤对铜负荷大鼠肝脏内Wnt/β-catenin信号通路的影响及其调控机制,为寻找治疗WD肝损伤的分子靶点提供理论依据。研究方法:雄性SD大鼠予以1g/kg/d的Cu SO4饲料及0.2ml/10g/d的0.185%Cu SO4水喂养12周制作铜负荷大鼠模型,造模成功后分别给予0.09g/kg/d青霉胺和0.2ml/10g/d中药肝豆汤灌胃给药,连续4周。采用离子体原子发射光谱法(ICP-AES)检测各组大鼠肝脏Cu、Fe、Zn微量元素的含量,HE染色方法检测大鼠肝组织病理变化,免疫组织化学法(Immunohistochemistry)检测大鼠肝组织Nitrotyrosine、8-Hydroxyguanosine蛋白以及Wnt/β-catenin信号通路相关蛋白β-catenin、p-β-catenin、GSK3β、p-GSK3β、DKK1、Dishevelled3、c-Myc的表达情况,免疫印迹法(WB)法检测大鼠肝组织Wnt/β-catenin信号通路β-catenin、p-β-catenin、GSK3β、p-GSK3β、DKK1、Dishevelled3、c-Myc蛋白的表达水平。实验结果:(1)ICP-AES法检测各组大鼠肝脏Cu、Fe、Zn微量元素含量的结果:与正常组相比,模型组肝脏Cu、Fe元素的含量显著升高(P<0.01),Zn含量(P>0.05)无差异;肝豆汤组与模型组大鼠相比肝脏Cu、Fe元素的含量降低(P<0.05),Zn元素含量(P>0.05)无统计学意义;PCA组与模型组大鼠相比肝脏Cu元素含量显著降低(P<0.01),Fe元素含量降低(P<0.05),Zn含量(P>0.05)无统计学意义。(2)HE染色结果:与正常组相比,模型组可见肝细胞大小不一、排列紊乱,部分肝索丧失,大部分肝细胞广泛重度水泡变性,胞浆空泡化;与模型组比较,肝豆汤组和PCA组大鼠肝组织细胞损伤程度明显降低。(3)免疫组化检测结果:与正常组相比较,模型组大鼠肝组织8-Hydroxyguanosine、Nitrotyrosine蛋白的阳性表达率显著增加(P<0.01),Wnt/β-catenin通路相关蛋白β-catenin、p-GSK3β、c-Myc阳性表达率显著降低(P<0.01),p-β-catenin、GSK3β、DKK1、Dishevelled3阳性表达率增加(P<0.05);与模型组相比较,肝豆汤组和PCA组8-Hydroxyguanosine、Nitrotyrosine蛋白阳性表达率显著降低(P<0.01),Wnt/β-catenin通路相关蛋白β-catenin、p-GSK3β、c-Myc阳性表达率显著增加(P<0.01),GSK3β、p-β-catenin、DKK1阳性表达率显著降低(P<0.01),Dishevelled3蛋白的阳性表达率降低(P<0.05)。(4)Western blotting法检测结果:与正常组比较,模型组β-catenin、p-GSK3β、c-Myc表达量显著降低(P<0.01),p-β-catenin、GSK3β、DKK1、Dishevelled3表达量显著增加(P<0.01);与模型组大鼠相比较,肝豆汤组和PCA组肝脏内β-catenin、p-GSK3β、c-Myc蛋白表达量显著增加(P<0.01),p-β-catenin、Dishevelled3蛋白表达量显著降低(P<0.01),GSK3β、DKK1蛋白表达量降低(P<0.05)。结论:1.铜负荷大鼠肝脏因过量铜的沉积可诱导肝细胞线粒体的氧化应激损伤,引起Wnt/β-catenin通路失活,诱导肝细胞的损伤。2.肝豆汤可降低铜负荷大鼠肝脏铜的含量,减轻铜诱导的氧化应激损伤,激活Wnt/β-catenin信号通路,减轻铜负荷大鼠的肝脏损害。因此,Wnt/β-catenin通路是WD肝损伤的潜在分子治疗靶点。