肝细胞癌（HCC）是原发性肝癌最主要的类型,具有高发病率、起病隐匿等特点,在我国,其发病率和死亡率一直居高不下,且死亡人数呈上升趋势。HCC是我国一项重大的健康问题,严重降低了患者的生活质量,影响了居民的生命健康,对其及其家庭造成巨大的社会及经济负担。在HCC早期,手术切除是最佳治疗手段,但由于医疗环境及患者防患意识薄弱等原因,发现时往往处于中晚期,此时手术切除疗效有限,诸如TACE等其他治疗手段也可能有复发及转移等风险。肝癌前病变是近年来研究比较广泛的领域,简而言之是指肝组织癌变前所发生的一系列变化,其发生发展受多种因素的调控,包括环境因素、基因突变、信号通路及其所调控的细胞因子等均可以影响HCC的发生,是一个多因素、多步骤、多途径的病变过程。在此阶段,肝卵圆细胞是核心环节,当受到特殊病理因素刺激时,其可被激活并转化为肝癌细胞。由于此阶段尚存在逆转的可能,因此被认为是预防及治疗HCC的理想靶点。但是由于目前的研究有限,其调控机制还未被完全阐明。Wnt通路是已经研究较多的信号通路,其作用机制也已较为清楚,目前研究最为深入细致的当属经典Wnt通路。现已探明经典Wnt通路与原发性肝癌的发生与发展密切相关,其异常激活可贯穿于HCC自发生至发展转移的全过程,故亦是防治HCC的重要研究方向。已有多项研究表明,中药可通过调控经典Wnt通路对原发性肝癌起到治疗作用,但是有关中药相关肝癌前病变的研究相对较少。益气凉血解毒方是依据益气健脾、凉血解毒为法则进行组方的经验复方,多年来其在肝癌的辅助治疗中疗效显著,已有研究表明其在大鼠肝癌前病变模型（肝卵圆细胞增殖模型）中可调控肝卵圆细胞的增殖分化,但其具体的作用机制还未研究清楚。故本研究希望通过构建大鼠肝癌前病变模型,通过RNAscope双染、HE染色及免疫组化染色等技术手段来研究益气凉血解毒方对肝癌前病变的阻断作用,并进一步研究其可能的作用机制,即对于经典Wnt通路的调控作用,以期对中医药防治肝癌前病变提供科学的依据,为后续进一步研究相关通路中的治疗靶点给予一定的理论支持。此外,我们还检测了经典Wnt通路在人肝细胞癌及对应癌旁肝硬变中的表达情况,并比较了通路中相关蛋白与临床参数间的关系,以期为临床治疗提供建议。第一部分益气凉血解毒方对大鼠肝癌前病变的阻断作用目的和意义构建大鼠肝癌前病变模型,镜下观察大鼠肝脏细胞在不同组别的形态及结构,比较其变化,进行HE染色及免疫组化染色以研究益气凉血解毒方对于大鼠肝癌前病变的阻断作用及影响。研究方法1将30只大鼠随机分为3组,每组10只,A组:大鼠肝癌前病变模型组（模型组）;B组:正常对照组;C组:益气凉血解毒方药组。其中,A、C两组构建大鼠肝癌前病变模型:通过 0.15g/L 二乙酰氨基芴（2-acetaminofluorene,2-AAF）灌胃 1 周+2/3 肝切除进行造模;C组进行干预:用益气凉血解毒方药对大鼠进行灌胃。造模于5周后结束。2通过苏木素—伊红（HE）染色技术对各组大鼠的肝脏细胞石蜡切片进行HE染色,观察比较不同组别大鼠肝组织细胞形态及结构的特征和变化。3通过免疫组织化学（IHC）染色技术对各组大鼠的肝脏细胞石蜡切片进行OV6及CD34染色,观察不同组别染色情况,比较不同组间的分布及染色程度,并进行半定量分析表达差异。结果1 HE染色:至5周末造模结束时,A组（模型组）可观察到大鼠肝脏结构中肝小叶部分消失,汇管区可见增生的胆小管,在其附近可观察到聚集的肝卵圆细胞和炎细胞,且以汇管区为中心可见部分肝卵圆细胞向肝实质内生长,临近肝板处有不同程度的破坏;B组（正常对照组）较正常肝组织无明显病理改变;C组（干预组）肝组织结构相对完整,肝小叶结构较A组（模型组）保存完整,细胞病理改变较轻,肝卵圆细胞呈轻度增生,可见少量变异的细胞。2免疫组化染色:A组（模型组）可在汇管区附近及肝小叶内观察到明显棕黄色染色,表明OV6及CD34呈高表达;B组（正常对照组）呈阴性,C组（干预组）可见少量棕黄色染色,表明OV6及CD34呈低表达,模型组与干预组及对照组间有明显差异。结论1大鼠肝癌前病变可观察到区别于正常肝组织的变化,程度虽然不及肝癌病变明显,但依然可观察到大量的肝卵圆细胞的增殖,可作为这一阶段的特殊变化。2通过益气凉血解毒方药等中药的干预,可见肝组织结构及形态相对于模型组有很大改观,肝卵圆细胞显著减少,提示中药可能具有阻断肝癌前病变的作用,其作用机制可能是通过调控肝卵圆细胞的增殖及分化来实现的。第二部分益气凉血解毒方对经典Wnt通路的调控作用目的和意义1研究经典Wnt通路中关键成分Wnt1和β-catenin的mRNA在各组中的定位及表达情况,比较其差异并分析益气凉血解毒方对大鼠肝癌前病变中经典Wnt通路的影响。2研究经典Wnt通路中关键成分Wnt1和β-catenin的蛋白在各组中的表达情况,比较其差异并分析益气凉血解毒方对大鼠肝癌前病变中经典Wnt通路的影响。研究方法1用RNAscope（?） 2.5可见光双染技术检测各组的Wnt1及β-catenin的mRNA表达及定位情况,分析比较各组的差异。2用免疫组化染色的方法检测各组大鼠肝组织中Wnt1及β-catenin蛋白的定位及表达情况,分析比较各组的差异。结果1 A组（模型组）可检测到Wnt1（红色）及β-catenin（绿色）两种mRNA同时存在,主要表达于肝组织汇管区附近,B组（正常对照组）及C组（干预组）含量较少或未检测到。2 A组（模型组）Wnt1及β-catenin蛋白均强阳性表达,表现为棕黄色染色,位于汇管区附近,也可见散在分布,表达于卵圆细胞或肝细胞的胞膜及胞质。C组（干预组）两种蛋白的染色程度减低,黄染面积相对于A组减少。在B组（正常对照组）可观测到少量Wnt1及β-catenin蛋白表达于肝细胞的胞膜及胞质处。结论1大鼠肝癌前病变肝组织中的Wnt通路关键分子Wnt1及β-catenin的基因呈现高表达,表明经典Wnt通路可能在肝癌前病变中处于异常激活状态,其表达在益气凉血解毒方干预后降低,说明益气凉血解毒方可能通过对Wnt通路的调控来阻断肝癌前病变的进展。2大鼠肝癌前病变肝组织中的Wnt通路关键分子Wnt1及β-catenin的蛋白呈现高表达,表明经典Wnt通路可能在肝癌前病变中处于异常激活状态,其表达在益气凉血解毒方干预后降低,说明益气凉血解毒方可能通过对Wnt通路的调控来阻断肝癌前病变的进展。第三部分人肝癌组织中Wnt1及β-catenin蛋白的表达情况目的和意义1检测人肝癌组织及其对应的癌旁肝硬变组织中Wnt1及β-catenin蛋白的表达情况,比较两组间蛋白的定位及定量的差异。2探讨两组间Wnt1及β-catenin蛋白与病理参数的关系。研究方法1分别对肝癌组织及癌旁肝硬变组织进行HE染色,观察两组的结构特征及病理变化。2通过免疫组化染色观察肝癌组和癌旁组肝硬变组中Wnt1及β-catenin蛋白的表达情况并比较其差异。结果1镜下可见肝癌组织中肝肿瘤呈细梁型或假腺管型,癌细胞为多角形,胞质丰富,为嗜酸性,细胞核为圆形,核仁明显,有轻度异型,大多数患者肝内肿物未侵入被膜,少数可见侵入被膜下,周围肝组织呈肝硬化改变。2免疫组化:在肝癌组织中,Wnt1主要定位于癌细胞的胞质,其次是胞膜,染色呈黄褐色,属阳性表达;在其对应的癌旁组织中,Wnt1大多为阴性表达,极少数可见胞质或胞膜有浅黄色颗粒样的染色,通过定量分析积分光密度并比较后发现,肝癌组中Wnt1明显高于癌旁肝硬变组,两组间有显著统计学差异（t=13.64,P＜0.001）;在肝癌组织中,β-catenin定位于癌细胞的细胞膜及细胞质,也可分布于细胞核,染色呈黄褐色或棕色,属阳性表达;在其对应的癌旁组织中,β-catenin呈阳性表达,分布于肝细胞的细胞膜,染色呈黄色,形态类似于网格状。通过定量分析积分光密度并比较后发现,肝癌组中β-catenin明显高于癌旁肝硬变组,两组间有统计学差异（t=7.31,P＜0.001）。3比较Wnt1及β-catenin与患者临床参数的关系后发现,β-catenin与肝癌分化程度有关,差异具有统计学意义（t=3.45,P=0.02）,二者呈现负相关关系（Spearman相关系数为-0.76,P＜0.001）。结论1 Wnt1及β-catenin在肝癌组织中及其对应的癌旁组织中表达情况具有明显差异,二者在肝癌组织中的表达均强于癌旁组织,提示经典Wnt通路在肝癌的发生发展中扮演了重要角色。2 β-catenin的表达情况在肝癌的不同病理分级之间有显著差异,且二者呈负相关,肝癌细胞分化程度越低,β-catenin的表达越高,提示β-catenin可能与患者的预后相关。