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近年来由于对虾病害的威胁,对虾养殖产业的发展受到了严重的影响。为了深入研究对虾病毒和发展有效的疾病防治策略,建立对虾细胞系的要求日益迫切。本文采用逆转录病毒介导的方法将细胞转化基因-猿猴病毒大T抗原基因(SV40LT)导入培养的中国对虾(Penaeus Chinensis)淋巴细胞(lymphoid cells)中,尝试对其进行转化培养。本研究旨在探索对虾细胞体外培养的可行技术,为对虾细胞的建系工作奠定基础。从携带SV40LT基因的质粒pLLTSN中高保真PCR扩增出2.1 Kb的SV40LT基因,将其插入到泛嗜性逆转录病毒载体(pantropic retroviral vector)pLXRN的BamHⅠ和XhoⅠ位点之间,构建重组载体pLXRN-SV40LT。酶切分析和测序验证结果表明,载体插入基因的位置、大小、序列均正确,成功构建重组泛嗜性逆转录病毒表达载体pLXRN-SV40LT。采用磷酸钙沉淀法将重组载体pLXRN-SV40LT与包装质粒pVSV-G共转染GP2-293细胞,病毒包装48小时后收集上清。经NIH3T3细胞测定,重组病毒的滴度为4×106 cfu/ml。以重组病毒感染原代培养的中国对虾淋巴细胞,经G418筛选阳性细胞后传代培养。细胞培养结果表明,转基因细胞株具有贴壁能力下降,从壁上脱落的细胞可悬浮生长等转化细胞的特征,传至10代时,其生长状态和分裂势头仍很好,而对照细胞只能传至3代;转基因细胞株传至12代时因真菌污染而丢失。PCR法检测第10代转基因细胞株基因组中的SV40LT基因,结果表明成功扩增出270 bp SV40LT片段,证实转基因细胞株基因组中较稳定的含有SV40LT基因;采用端粒重复序列扩增法(TRAP)分析转基因细胞株的端粒酶活性,聚丙烯酰胺凝胶电泳结果显示,转基因细胞株的端粒酶活性明显高于原代对照细胞,这从一个侧面反映了转基因对虾细胞株获得了转化的特性。本研究有希望发展成为建立对虾永生化细胞系的可行技术,同时为探索其他海洋无脊椎动物细胞的建系方法提供了有益的借鉴。