背景:　　全球范围内，乳腺癌的发病率已经超过宫颈癌，居于女性恶性肿瘤的首位。化疗是乳腺癌常用的治疗方案。阿霉素是一种蒽环类细胞毒抗生素，可以抑制肿瘤细胞DNA和RNA的合成，主要用于治疗乳腺癌、骨肉瘤、白血病等恶性肿瘤。但临床上发现长期使用阿霉素治疗乳腺癌细胞导致患者对阿霉素产生耐药性，从而导致化疗失败。因此，乳腺癌对阿霉素耐药性已成为亟待解决的问题。　　细胞自噬(autophagy)是真核细胞内广泛存在的一种高度保守的对细胞内物质进行周转的重要过程。细胞在缺氧、饥饿、化疗药物刺激等应激条件下通过自我分解损坏的蛋白或细胞器以维持细胞内环境稳态的一种方式，有利于细胞在不利条件下获得生存优势。有研究指出，肿瘤细胞的保护性自噬可能是针对抗癌药物产生耐药性的一个潜在机制，细胞保护性自噬可以克服化疗引起的部分压力，从而导致化疗效果下降。　　MicroRNAs(miRNAs)是一种长度在19-25个核苷酸的单链非编码小RNA分子，其通过碱基互补配对方式与靶基因mRNA3UTR区域结合，导致靶mRNA降解或抑制其翻译。最近有研究指出，miRNA可通过调节自噬相关蛋白表达，从而调控细胞自噬在肿瘤中发生发展过程中起作用。我们前期采用高通量miRNA表达分析系统，从Balb/c裸鼠骨肉瘤异种移植物模型中筛选出对阿霉素反应良好的miRNA表达谱，microRNA-502-5p(miR-502)是其中差别最显著的miRNA之一。编码人hsa-miR-502的基因位于X染色体。有研究报道miR-502在乳腺癌、肾癌、肝癌和结直肠癌组织中低表达，在肿瘤细胞增殖、侵袭和转移过程中起到抑制作用，并且miR-502可通过靶向Rab1B抑制结肠癌细胞自噬及其增殖能力。但miR-502与阿霉素敏感性的关系及机制尚不清楚。　　ATG16L1(autophagy related16 like1)是一种主要的自噬相关蛋白，可与ATG5和ATG12形成复合物，ATG16L1-ATG5-ATG12复合物可调节微管相关蛋白轻链3(LC3)与磷脂酰乙醇胺(PE)结合的位点，从而起到新型E3样酶的作用，促进自噬体膜的形成。miRNA分析软件Targetscan预测ATG16L1可能是miR-502的靶点之一。因此，我们推测miR-502可能通过靶向ATG16L1抑制细胞自噬，从而促进乳腺癌细胞对阿霉素的敏感性。　　目的:　　(1)验证miR-502与ATG16L1的靶向关系;　　(2)探讨miR-502/ATG16L1轴在乳腺癌细胞阿霉素敏感性中的作用及机制。　　方法:　　(1)通过对乳腺癌细胞系MCF-7细胞进行小剂量开始、逐渐加量、间断给药的方法诱导乳腺癌阿霉素耐药细胞系MCF-7/ADR;通过CCK-8法检测阿霉素在两种细胞中的半数致死浓度(IC50)。以MCF-7/ADR及其亲本细胞MCF-7为实验对象，miR-502上调实验是在MCF-7/ADR细胞中利用lipofectamine2000分别转染miR-502 mimic（miR-502组）、miRNA无关序列（NC组）和针对ATG16L1的siRNA（siATG16L1组）;miR-502下调实验是在MCF-7细胞中利用lipofectamine2000转染miR-502 inhibitor（502i组）和miRNA inhibitor无关序列(NCi组)。　　(2)通过Taqman探针法qRT-PCR检测miR-502表达水平;通过SYBR Green染料法qRT-PCR检测ATG16L1 mRNA水平。通过Western blot实验检测ATG16L1及自噬标志蛋白LC3-Ⅱ和P62蛋白表达水平。　　(3)通过miRNA分析软件Targetscan预测miR-502和ATG16L1 mRNA3UTR的结合位点。化学合成包含miR-502结合位点的野生型ATG16L1 mRNA3UTR双链(WT)和miR-502结合位点突变的的突变型ATG16L1 mRNA3UTR双链(Mut)，将人工合成的ATG16L13UTR野生型和突变型双链寡核苷酸插入到GP-miRGLO载体的SacⅠ和XhoⅠ位点，通过双荧光素酶报告实验验证ATG16L1是miR-502的直接靶点。　　(4)在MCF-7/ADR细胞利用lipofectamine2000共转染miR-502 mimic和GFP-LC3质粒（miR-502+GFP-LC3组），以共转染miRNA无关序列和GFP-LC3质粒（NC+GFP-LC3组）为对照;在MCF-7细胞中共转染miR-502 inhibitor和GFP-LC3质粒（502i+GFP-LC3组），以共转染miRNA inhibitor无关序列和GFP-LC3质粒（NCi+GFP-LC3组）为对照。转染24小时后加相应浓度的阿霉素进行自噬诱导，药物诱导12小时后在倒置荧光显微镜下进行观察计数，在每种条件下计数最少100个细胞，并计算GFP-LC3阳性细胞（细胞内具有超过5个明亮的绿色荧光斑点）相对于总细胞的百分比。　　结果:　　(1)CCK-8实验结果显示乳腺癌阿霉素耐药细胞MCF-7/ADR的成功构建，其阿霉素IC50为16.41士0.07μg/ml，是MCF-7细胞（0.22±0.02μg/ml）的75.98士0.11倍。光学显微镜观察发现，与对应的亲本MCF-7细胞相比，MCF-7/ADR细胞的体积变大，边缘圆润，细胞之间排列松散，胰酶消化时间缩短。　　(2)实时定量qRT-PCR结果显示MCF-7/ADR细胞内源性miR-502表达水平明显低于MCF-7(P＜0.01)，而实时定量qRT-PCR和Westem blot结果显示MCF-7/ADR细胞内源性ATG16L1 mRNA和蛋白水平均显著高于MCF-7细胞(P＜0.01)，并且MCF-7/ADR细胞的LC3-Ⅱ蛋白水平明显高于MCF-7细胞，而P62水平则明显低于MCF-7细胞。　　(3)乳腺癌阿霉素耐药细胞MCF-7/ADR共转染miR-502 mimic和野生型ATG16L13UTR载体质粒组的相对荧光素酶发光值明显低于共转染miRNA无关序列NC和野生型ATG16L13UTR载体质粒组(P＜0.05)，而共转染miR-502mimic和突变型ATG16L13UTR载体质粒组与共转染miRNA无关序列NC和ATG16L1突变型3UTR载体质粒组的相对荧光素酶发光值没有明显差异(P＞0.05)。　　(4)实时定量qRT-PCR和Western blot结果显示MCF-7/ADR细胞miR-502组的ATG16L1mRNA和蛋白水平均显著低于NC组(P＜0.01)，而MCF-7细胞502i组显著高于NCi组(P＜0.01)。CCK-8实验结果显示MCF-7/ADR细胞miR-502组的阿霉素IC50显著低于NC组(P＜0.05)，siATG16L1组的阿霉素IC50也显著低于NC组(P＜0.05)，而MCF-7细胞502i组的阿霉素IC50显著高于NCi组(P＜0.05)。　　(5)Western blot实验结果显示，MCF-7/ADR细胞miR-502组和siATG16L1组中LC3-Ⅱ蛋白水平均低于NC组，P62蛋白水平均高于NC组;相反地，MCF-7细胞502i组的LC3-Ⅱ蛋白水平高于NCi组，P62蛋白水平低于NCi组。荧光显微镜下GFP-LC3分析结果显示，MCF-7/ADR细胞共转染miR-502+GFP-LC3组的GFP-LC3阳性细胞占总转染细胞群的百分比显著低于共转染NC+GFP-LC3组(P＜0.01)，而MCF-7细胞共转染502i+GFP-LC3组的GFP-LC3阳性细胞占总转染细胞群的百分比显著高于共转染NCi+GFP-LC3组(P＜0.05)。　　结论:　　(1)在乳腺癌细胞中ATG16L1是miR-502的直接靶点，miR-502是在转录后水平抑制ATG16L1表达。　　(2) miR-502通过靶向下调ATG16L1抑制细胞自噬，促进乳腺癌细胞对阿霉素敏感性。miR-502可能成为逆转阿霉素耐药的潜在候选靶点。