冀产翻白草指纹图谱研究

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翻白草为蔷薇科委陵菜属植物翻白草Potentilla discolor Bunge.的干燥全草,在我国传统医药典籍和民间均有广泛记载,为《中国药典》(2010年版)新收录品种。其主要化学成分为黄酮类、三萜类和多酚类,具有清热解毒、消肿止血、抗炎止泻、免疫抑制、降糖降脂等功效。翻白草在我国各地均有分布,均为野生,由于资源分散,不易采集,且与同属植物委陵菜外观相似,易被混用。同时受生长环境影响,不同地区翻白草化学成分含量也不尽一致。而《中国药典》仅对其显微鉴别和薄层鉴别做了规定,因此,有必要建立更为科学的翻白草质量控制方法。  中药材所含化学成分复杂、含量差异较大,且往往是多种成分共同发挥特定疗效,因此,仅仅通过测定或鉴别有限数目的有效成分还不足以评价中药材的质量。中药化学指纹图谱技术是将中药材中所含的特有化学信息以相应特征图形图像的方式展示,与理化鉴别、有限成分的含量测定相比,其更能体现中药材化学成分的整体特征。本研究即采用高效液相色谱技术,建立了翻白草指纹图谱分析方法,并对其主要成分槲皮素进行了定量测定,为翻白草的有效质量控制提供了新的依据。  目的:建立河北产翻白草HPLC-UV指纹图谱分析方法,并测定槲皮素含量,完善对翻白草质量的客观评价和有效控制。  方法:  1.建立HPLC-UV指纹图谱(1)提取条件:通过选择不同有机溶剂,在不同提取方法下,经过不同提取时间,选择最终提取成分相对较多、提取率较高的条件。(2)色谱条件:调整流动相组成、配比及流速,选择合适的紫外检测波长,使图谱出峰相对较多、分离度较好。(3)系统适用性试验:以确定的色谱条件,计算评价指纹图谱中槲皮素峰(S峰)理论塔板数和与其他成分峰的分离度。(4)稳定性试验:取供试液分别在0h、6h、12h、24h和48h进样,记录槲皮素峰(S峰)和主要色谱峰保留时间、峰面积。(5)精密度试验:取同一供试溶液,重复进样6次,记录槲皮素峰(S峰)保留时间和峰面积。(6)重现性试验:取同批翻白草6份,平行制备供试品溶液,进样测定,记录槲皮素峰(S峰)保留时间和峰面积。(7)样品分析:分别取翻白草12批,按既定条件进行指纹图谱分析,分析色谱峰差别,并采用相似度软件进行分析。  2.槲皮素含量测定(1)绘制标准曲线:配制系列浓度槲皮素对照品溶液,进样,记录峰面积,绘制标准曲线。(2)精密度试验:取同一样品溶液重复进样6次,测定峰面积。(3)重复性试验:取翻白草平行制备样品溶液6份,分别进样,测定峰面积。(4)回收率试验:取已知槲皮素含量的翻白草5份,加入已知量槲皮素对照品溶液,按既定方法制备供试品溶液,测定槲皮素的含量。(5)检测限:逐渐稀释样品直至其所产生信号为背景信号的3倍值所对应的浓度。(6)稳定性试验:取同一样品溶液5份分别在0h、6h、12h、24h和48h进样,测定峰面积。(7)样品测定:按上述色谱条件,测定12批翻白草中槲皮素的含量。  结果:  1.建立HPLC-UV指纹图谱(1)提取条件:选择95%甲醇-20%盐酸体积比4∶1,加热回流40min。(2)色谱条件:色谱柱为Hypersil ODS2(250 mm×4.6 mm,5μm);流动相为甲醇-0.4%磷酸,梯度洗脱,流速1mL/min,柱温20℃,紫外检测波长为255nm,进样量10μL。(3)系统适用性试验:槲皮素峰的保留时间约为40.2min,理论塔板数约为22万,与其它峰分离度均大于1.0。(4)稳定性试验:选择槲皮素峰作为内参比峰,记录主要色谱峰相对保留时间和相对峰面积值。RSD分别为0.13%~0.95%和2.16%~2.77%。(5)精密度试验:主要色谱峰相对保留时间和相对峰面积比值无明显变化,RSD分别为0.09%~0.92%和2.29%~2.92%,精密度良好。(6)重现性试验:主要色谱峰相对保留时间和峰面积比值均无明显变化,RSD分别为0.13%~2.40%和2.10%~2.97%,重现性良好。(7)样品测定:得到的图谱表明各样品差异性较大,即使同一供货源不同批次的样品也存在显著差别。相似度范围0.051-0.908。  2.槲皮素含量测定(1)标准曲线:Y=7329X+19716,r=0.998(n=5)。(2)精密度试验:检测精密度好,RSD为2.90%。(3)重复性试验:检测重复性好,RSD为2.90%。(4)回收率试验:槲皮素的回收率为99.53%,RSD为1.51%。(5)槲皮素的最低检测限为0.01mg。(6)稳定性试验:样品在48h内稳定,RSD值为1.78%。(7)样品测定:不同来源翻白草槲皮素的含量范围0.22~0.59mg/g,另有三组未检出。  结论:本实验首次建立了河北产翻白草指纹图谱分析方法,同时测定了槲皮素含量,方法重现性和精密度良好,有助于翻白草的质量控制。
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