近年来,大量研究证据表明,表观遗传修饰对正常脑功能（如学习记忆）起重要的调节作用,并且多种认知障碍相关的神经精神疾病的发病机制都与表观遗传修饰的异常有关。DNA甲基化是目前研究最多的一种表观遗传修饰形式。在学习过程中,外界环境的刺激可以动态的调控DNA甲基化,而甲基化通过调节脑中特定基因的转录来调节记忆的形成和存储。DNA甲基化是指在甲基转移酶（DNA methyltransferases,DNMT）的催化作用下,将来自于S-腺苷甲硫氨酸中的一个甲基转移到CpG二核苷酸中胞嘧啶的5号碳原子上,形成5-甲基胞嘧啶。哺乳动物中,DNA甲基化主要受到三种甲基转移酶调节。DNMT1为维持性甲基转移酶,主要负责在半甲基化的DNA链上引入甲基基团,来维持细胞的甲基化水平;DNMT3A和DNMT3B为从头合成甲基转移酶,可以向未甲基化的CpG二核苷酸的胞嘧啶添加新的甲基基团,形成新的甲基化位点。三者相互协调,使得DNA甲基化在细胞分裂中可以保持延续性和稳定性。其中,DNMT1和DNMT3A在成熟神经元中也有较高表达,是起主要作用的DNA甲基化转移酶。大量研究提示DNMT1和DNMT3A介导的甲基化修饰对成熟神经元的功能（如学习和记忆）具有重要的调节作用,而且两种酶的功能是重叠和互补的,但具体作用机制目前尚不十分明确。为了深入探讨DNA甲基化修饰对不同脑区及不同类型神经元功能及学习记忆的影响并探讨其分子细胞机制,我们首先用AAV-Cre-GFP病毒定位注射的方法,通过Cre-LoxP重组酶系统对小鼠背侧海马CA1区成熟神经元内Dnmt1和Dnmt3a基因进行时空特异性共敲除（硕士期间工作）,同时利用B6.Cg-Tg（CaMK2α-cre）T29-1Stl/J工具鼠建立能够特异性共敲除海马CA1区成熟兴奋性神经元内Dnmt1和Dnmt3a表达的αCaMKII-Cre;Dnmt1,3a^2flox/2flox条件性双敲小鼠。在整体水平上,我们利用高架十字迷宫、旷场实验、新位置识别、社交选择、Morris水迷宫和转棒等一系列行为学范式对两种条件性敲除小鼠的学习记忆能力进行了测试。在离体脑片上,我们利用全细胞膜片钳和场电位记录对双敲小鼠海马神经环路的突触功能和神经元的固有兴奋性进行了分析。在基因组和蛋白分子水平上,我们利用转录组基因芯片、转录组全基因测序、全基因组甲基化测序、蛋白质印迹和逆转录聚合酶链式扩增反应等多种实验方法和技术手段,对引起突触功能和动物行为改变的分子机制进行了探讨,以寻找可能被调控的靶基因。具体研究结果如下:1.选择性敲除CA1脑区Dnmt1和Dnmt3a对小鼠学习记忆的影响。1.1αCaMKII-Cre小鼠与Gt（ROSA）26Sor^tm1（EYFP）Cos荧光报告小鼠杂交,显示CRE重组酶的表达位置主要在海马的CA1区,且αCaMKII-Cre;Dnmt1,3a^2flox/2flox条件性基因共敲除小鼠海马CA1区Dnmt1和Dnmt3a的敲除率与对照组相比,分别减少了40%和30%（图3所示）。1.2高架十字迷宫和旷场实验结果显示,αCaMKII-Cre;Dnmt1,3a^2flox/2flox条件性基因共敲除小鼠的焦虑状态和自发活动与对照Dnmt1,3a^2flox/2flox小鼠相比,无异常（图4所示）。这些结果与我们前期通过局部脑区定位注射AAV-Cre-GFP病毒以敲除Dnmt1,3a^2flox/2flox小鼠海马CA1区Dnmt1和Dnmt3a表达所得的实验结果相一致。1.3新位置识别、社交偏好和水迷宫实验结果显示,αCaMKII-Cre;Dnmt1,3a^2flox/2flox条件性共敲除小鼠表现出海马依赖性的记忆障碍,包括物体位置识别记忆障碍,社交识别记忆障碍和空间记忆障碍（图5所示）。这些结果与我们前期通过局部脑区定位注射AAV-Cre-GFP病毒以敲除Dnmt1,3a^2flox/2flox小鼠海马CA1区Dnmt1和Dnmt3a表达所得的实验结果相一致。1.4转棒实验结果显示,与对照Dnmt1,3a^2flox/2flox小鼠相比,αCaMKII-Cre;Dnmt1,3a^2flox/2flox条件性共敲除小鼠的运动学习能力增强（图6所示）。2.Dnmt1和Dnmt3a共敲除影响学习记忆的细胞机制。2.1海马脑片兴奋性突触后场电位（field excitatory postsynaptic potentiation,fEPSP）记录结果显示,与对照Dnmt1,3a^2flox/2flox小鼠相比,αCaMKII-Cre;Dnmt1,3a^2flox/2flox条件性共敲除小鼠海马突触可塑性存在异常,具体表现为长时程抑制（long-term depression,LTD）有增强趋势、而长时程增强（long-term potentiation,LTP）、基础的兴奋性突触传递和成对脉冲比值（PPR）无异常（图7所示）。2.2脑片全细胞膜片钳记录结果显示,与对照Dnmt1,3a^2flox/2flox小鼠相比,αCaMKII-Cre;Dnmt1,3a^2flox/2flox条件性共敲小鼠海马神经元突触传递功能异常,具体表现为自发型（spontaneous）和微小型（miniature）抑制性突触后电流（inhibitory postsynaptic current,IPSC）频率降低,幅度不变。自发型和微小型兴奋性突触后电流（excitatory postsynaptic current,EPSC）的频率和幅度均无变化（图8所示）。2.3脑片全细胞膜片钳记录结果显示,与对照Dnmt1,3a^2flox/2flox小鼠相比,αCaMKII-Cre;Dnmt1,3a^2flox/2flox条件性共敲小鼠海马CA1区锥体神经元的固有兴奋性明显增强,具体表现为同一去极化电流诱发的动作电位个数明显增多,此外,我们还发现,海马CA1区立体定位注射钙依赖性钾离子通道激动剂CyPPA可部分改善αCaMKII-Cre;Dnmt1,3a^2flox/2flox基因共敲除小鼠的记忆障碍（图9所示）。3.Dnmt1和Dnmt3a共敲除影响学习记忆的分子机制。3.1αCaMKII-Cre;Dnmt1,3a^2flox/2flox条件性共敲除小鼠海马CA1区基因表达谱芯片结果显示（图10所示）,表达量上调1.5倍以上的基因有166个,下调1.5倍以上的基因有138个;转录组测序结果显示,表达量上调2倍以上的基因有2490个,下调2倍以上基因有3466个;全基因组甲基化测序结果显示,甲基化水平上调10%以上的基因有2898个,下调10%以上的基因有4986个。其中,我们发现差异表达趋势一致且CG甲基化水平亦发生改变的基因共有4个,分别为β-半乳糖苷α-2,6唾液酸转移酶2（beta-galactoside alpha-2,6 sialyltransferase 2,St6gal2）,激活转录因子7相互作用蛋白2（activating transcription factor 7 interacting protein 2,Atf7ip2）,胰岛素受体相关受体（insulin receptor-related receptor,Insrr）以及2-5寡聚腺苷酸合成酶类酶1（2-5oligoadenylate synthetase-like 1,Oasl1）。3.2结合基因表达谱芯片技术,转录组测序和全基因组甲基化测序对αCaMKII-Cre;Dnmt1,3a^2flox/2flox条件性双敲小鼠和对照Dnmt1,3a^2flox/2flox小鼠海马CA1区的差异基因进行筛选,筛选后进行qRT-PCR和Western blot验证,结果显示,αCaMKII-Cre;Dnmt1,3a^2flox/2flox条件性双敲小鼠海马CA1区St6gal2的mRNA和蛋白表达水平均上调。腺相关病毒AAV-St6gal2-shRNA-eGPF介导的CA1内St6gal2小干扰RNA表达,可以改善αCaMKII-Cre;Dnmt1,3a^2flox/2flox条件双敲小鼠海马依赖的记忆障碍（图11所示）。3.3考虑到αCaMKII-Cre;Dnmt1,3a^2flox/2flox基因共敲除小鼠海马CA1区锥体神经元的固有兴奋性显著增加这一事实,我们应用qRT-PCR技术对芯片中大量差异表达的离子通道基因进行了验证,结果发现,αCaMKII-Cre;Dnmt1,3a^2flox/2flox基因共敲除小鼠CA1区的中间电导钙依赖的钾离子通道(intermediate-conductance Ca²⁺-activated K⁺channels,KCa3.1)的mRNA和蛋白水平均降低,且腺相关病毒AAV-Kcnn4介导的CA1区Kcnn4过表达能够改善αCaMKII-Cre;Dnmt1,3a^2flox/2flox小鼠的识别记忆障碍,同时抑制其运动学习能力（如图12所示）。3.4 Western blot结果显示,与Dnmt1,3a^2flox/2flox小鼠相比,αCaMKII-Cre;Dnmt1,3a^2flox/2flox基因双敲小鼠海马CA1区AKT的磷酸化水平明显降低（图13所示）。综上所述,我们发现,与前期通过脑区定位注射AAV-Cre-GFP病毒局部脑区定位注射的方法以实现海马CA1区成熟神经元中Dnmt1和Dnmt3a共敲除所得到的实验结果相一致,海马CA1区成熟的兴奋性神经元内选择性双敲Dnmt1和Dnmt3a导致小鼠海马依赖的记忆障碍。在突触和细胞水平上,我们发现αCaMKII-Cre;Dnmt1,3a^2flox/2flox基因双敲小鼠海马神经元抑制性突触后电流下降和固有兴奋性增强,进而导致SC-CA1通路异常,具体表现为LTD有增强的趋势。在分子水平上,我们发现αCaMKII-Cre;Dnmt1,3a^2flox/2flox基因双敲小鼠海马CA1区St6gal2基因的转录水明显上调,而Kcnn4基因的转录水平下调。并且干扰St6gal2的表达可以改善小鼠的位置记忆障碍,且高表达Kcnn4不仅可以改善小鼠的位置记忆障碍而且还可以抑制小鼠的运动学习能力的增强。通过对信号通路的探讨,我们还发现αCaMKII-Cre;Dnmt1,3a^2flox/2flox基因双敲小鼠海马CA1区AKT磷酸化水平降低,而AKT的激活与Kcnn4的表达之间的关系前期也有大量报道。因此我们初步得出结论,小鼠海马CA1区成熟兴奋性神经元中Dnmt1和Dnmt3a基因的共敲除可以上调St6gal2基因,以及下调Kcnn4基因的表达,我们推测这两个靶基因导致神马神经环路的突触传递功能、神经元内在兴奋性以及突触可塑性发生异常,并最终造成海马依赖的记忆障碍和运动学习能力的增强。Dnmt1以及Dnmt3a的敲除如何调节St6gal2和Kcnn4,这两个靶基因之间是如何作用的,以及这两个基因如何影响海马神经元突触功能和兴奋性的具体机制尚有待进一步研究和验证。本研究为包括阿尔兹海默症、帕金森病、自闭症、脆弱综合征、抑郁症及精神分裂症等在内的多种与表观遗传调控尤其是DNA甲基化异常相关的神经精神疾病认知障碍的治疗,提供了新的可能的靶向调控基因St6gal2和Kcnn4。从长远来说,这些研究不仅有助于深化我们对学习记忆及其分子细胞机制的认识,同时对伴有认知障碍的神经精神疾病的病因学研究及治疗将带来深远的影响。